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鸡胚原代细胞培养鸡胚原代细胞培养鸡胚原代细胞培养鸡胚原代细胞培养[实验材料]9~10日龄鸡胚,Hank"s液50mL,0.5%水解乳蛋白液或MEM培养液20mL(内含犊牛血清1mL,双抗0.2mL,pH7.2),O.25%胰蛋白酶5mL、7%NaHC031mL,手术剪,镊子,灭菌的培养皿,50mL三角瓶,滴管若干,链霉素小空瓶若干(加入细胞悬液培养用),高压灭菌塞子若干,培养盘,蛋座,95%酒精,水浴锅。[实验内容及操作程序]1.配液制备细胞前先在Hnak"s液中加青、链霉素,使其含量为青霉素100IU/mL,链霉素100μg/mL,用7%NaHC03调整pH至7.2~7.4,将胰蛋白酶调整pH7.6(玫瑰红色)。置37℃水浴锅中预热备用。2.取胚及剪碎将胚蛋气室端向上直立于蛋座上,用碘酊消毒气室,以镊子击破卵壳并弃之,撕破卵膜揭之,继撕破绒尿膜、羊膜,取出胚胎于灭菌平皿中。剪去头部、翅爪及内脏,用Hank"s液(简称H液)洗去体表血液,移人灭菌三角瓶中,用灭菌剪刀剪碎鸡胚,使成为约1mm3大小的碎块,加5mLH液轻摇,静止1~2min,使其组织块下沉。吸去上层悬液,依同法再洗2次,至上悬液不混浊为止,吸干H液留组织。3.消化自水浴锅内取出预热的胰酶,按组织块量约3~5倍加入三角瓶中,1个鸡胚约需5mL胰酶,三角瓶上加塞,以免CO2挥发及污染。37℃水浴约20min左右,每隔5min轻轻摇动1次,由于胰酶作用,使细胞与细胞之间的氨基和羧基游离,待液体变混而稍稠,此是再轻摇可见组织块悬浮在液体内而不易下沉时,则需中止消化,如再继续消化下去可破坏细胞膜而不易贴壁生长,如果消化不够,则细胞不易分散。4.洗涤取出三角瓶后静置1min,让组织块下沉后,吸去胰酶液,用10mLHank"s液反复轻洗3次,以洗去胰酶,吸干上清液,留组织块。5.吹打加2mL含血清的0.5%水解乳蛋白营养液或:MEM培养液,以粗口吸管反复吹吸数次,使细胞分散,此时可见营养液混浊即为细胞悬液。静置1min,使未冲散的组织块下沉后,小心地将细胞悬液吸出1mL于20mL营养液中,此液细胞数约50万~70万/mL。如需大量细胞,可继续加营养液冲打,一个鸡胚约可做100mL细胞悬液。6.细胞计数取上述细胞悬液0.5mL加入0.1%结晶紫一柠檬酸(0.1mol/L)溶液2mL,置室温或37℃温箱中5~10min,充分振动混合后,用毛细管吸取滴人血细胞计数板内,在显微镜下计数。计数方法按白细胞计数法,计算四角大格内完整细胞的总数。如3~5个聚集在一起,则按1个计算,然后将细胞总数按下法换算成每毫升中的细胞数。细胞数/mL=4大格细胞总数/4×10000×稀释倍数例如:4大格的细胞总数为284个,而稀释倍数为5(0.5mL染色液),则每毫升细胞悬液的细胞数为284/4×10000×5=3.5×104个。7.稀释按照每毫升50万~70万个细胞密度的标准,将细胞悬液用营养液稀释之。(计数时,可见到大部分细胞完整分散,3~5个细胞成堆,且细胞碎片很少,说明消化适度;如分散细胞少,则消化不够;如细胞碎片多,则消化过度。)活细胞计数法取2%台盼蓝溶液1滴,细胞悬液1滴,混合计数,活细胞不着色,死细胞呈蓝色。8.分装培养分装于链霉素瓶中,每瓶约1mL,瓶口橡皮塞要塞紧。不合适者弃去,以免漏气造成污染或C02跑掉而营养液变碱。将细胞瓶横卧于培养盘中,于瓶上面划一直线,以表示直线的对侧面为细胞在瓶内的生长位置。瓶上注明组别、日期,置37℃温箱培养,4h后细胞即可贴附于瓶壁,24~36h生长成单层细胞,此时可吸去培养液,更换维持液,并接种病毒。附:HYPERLINK""\t"_blank"细胞培养所需的常用培养基与试剂1.Hank’s液配制原液甲NaCl8gKCl2gMgSO4·7H202gMgCl2·6H202g2.8%CaCl2100mL双蒸水加至1000mL先将固体成分加于800mL双蒸水中,加温到50~60℃加速溶解,再加入CaCl2溶液,最后加双蒸水补足到1000mL。加氯仿2mL,摇匀后于4℃贮存。原液乙Na2HPO4·2H201.2gKH2PO4·2H201.2g葡萄糖20g0.4%酚红lOOmL双蒸水加:1000mL将上列各物混合后使其溶解,加氯仿2mL,摇匀后于4℃贮存。Hank"s工作液原液甲1份原液乙1份双蒸水18份工作液分装100mL,或500mL盐水瓶中,115~C灭菌10min,使用前以7%NaHCO3调节pH至07.2~7.6。2.0.4%酚红溶液配制酚红0.4g0.1%NaOH溶液11.28mL将酚红置于研钵