PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体优化及蛋白表达.pdf

中国医药生物技术2021年6月第16卷第3期ChinMedBiotechnol,June2021,Vol.16,No.3215论著··DOI:10.3969/j.issn.1673-713X.2021.03.004PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体优化及蛋白表达程艳，万婷婷，薛荣亮【摘要】具有高效且快速的细胞转导能力[2]。目的优化PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体以增加大肠杆菌原核表达体系是基因表达技术中发SOD融合蛋白表达。展最早，应用最广泛的经典表达系统，近几十年，方法通过基因工程设计引物并优化PTD4-Cu,Zn-SOD原大肠杆菌表达系统也得到不断发展和完善，被科研核重组表达载体，扩增并鉴定目的基因，将优化后的原核重及工业用户大量用于各种重组蛋白表达。与其他表组表达载体以热激法转化至E.coliBL21(DE3)中，通过达系统相比，具有目的基因表达水平高、培养周期IPTG诱导重组载体进行蛋白表达，通过溶菌酶+超声裂短、抗污染能力强、成本相对低等特点[3]。本课题解菌体，离心后收集上清，利用Ni-NTA树脂纯化，10kD，组前期已成功构建PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表20kD透析袋浓缩，以获得SOD融合蛋白。利用达载体[4]，并成功制备PTD4-Cu,Zn-SOD融合蛋白SDS-PAGE凝胶电泳及Westernblot鉴定SOD融合蛋（简称SOD融合蛋白）[5]。本实验在前期实验的白。采用BCA与黄嘌呤氧化酶法测定SOD融合蛋白浓度基础上，在充分考虑大肠杆菌（E.coliBL21(DE3)）及活力。的密码子偏好的基础上，根据密码子的简并性，在不改变氨基酸的前提下，替换了原序列中的稀有密结果优化后的重组表达载体优化了稀有碱基，增加了码子（AGG，AGA）以及低利用率密码子，选择大His·Tag标签，His·Tag-PTD4-Cu,Zn-SOD序列作为一个整肠杆菌高偏好性的密码子，对pET16b-PTD4-Cu,体，在NcoI与BamHI限制性内切酶作用下定向插入，Zn-SOD基因序列进行了优化，以期更加稳定地增构建了长度为6213bp的优化质粒，基因测序结果与预先加SOD融合蛋白的表达。设计的序列对比显示碱基序列正确。优化后的SOD融合蛋白表达量约占菌体的32%，较前（20%）提高，纯化浓缩1材料与方法后纯度为94%，较前（90%）增加。测定浓度为1.8mg/ml，1.1主要材料37℃时SOD总活力为（3065.137±19.75）U/mgprot。E.coliBL21(DE3)购自北京擎科新业生物技结论通过重组表达载体密码子优化，可以获得高产量、高术有限公司；PTD4-Cu,Zn-SOD基因序列由薛荣亮活性的SOD融合蛋白。课题组提供；pET16b质粒、pBluescriptIISK-Cu,【关键词】蛋白质结构域；超氧化物歧化酶；质粒Zn-SOD购自北京天恩泽基因科技有限公司；KODwww.cmbp.net.cn中国医药生物技术,2021,16(3):215-221plusDNApolymerase购自日本Toyobo公司；DNA连接试剂盒、限制性内切酶BamHI、NcoI、过氧化反应与多种神经退行性疾病关系密切，T4DNA连接酶购自日本Takara公司；质粒小量提其产生的活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）取试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司；西班牙是造成神经元死亡的主要原因。超氧化物歧化酶琼脂糖、考马斯亮蓝染液、LB固培养基、BCA试（superoxidedismutase，SOD）是针对ROS的主剂盒购自西安赫特生物科技有限公司；HisTag单要抗氧化剂防御系统，但其分子量大且无特异性受体，难以穿过血脑屏障及细胞膜进入脑内发挥作用。蛋白质转导结构域（proteintransductiondomain，基金项目：国家自然科学基金（81471131）PTD）是一个以肽为载体的能够有效运输各种物质作者单位：710068西安，陕西省人民医院麻醉科（程艳）；710100西进入细胞和细胞核的系统，能够把生理状态下不能安，西安国际医学中心医院麻醉与舒适化医疗中心（薛荣亮）；100191北京，北京大学第三医院麻醉科（万婷婷）进入细胞发挥生物效应的物质带入细胞的载体工通信作者：薛荣亮，Email：****************具[1]。PTD-4结构域的二级结构具有双亲性，因而收稿日期：2020-12-15216中国医药生物技术2021年6月第16卷第3期ChinMedBiotechnol,June2021,Vol.16,No.3克隆抗体、山羊抗小鼠IgG二抗-HRP辣根过氧化AAGAGTGGTGATGATGGTGATGATGGTGGTGG物酶标记购自美国Earthox公司；IP