多酶催化途径的体外构建.doc

多酶催化途径的体外构建体外多酶催化是合成生物学领域发展非常迅速的一种研究方法,它是利用纯化的酶以及辅酶,通过一定的生物化学反应,将底物转化为目标产物的过程。利用体外代谢催化方法,可以不去阐明生物体复杂的细胞代谢,可以提高研究效率。鉴于体外多酶催化方法的优点,在体外对苏氨酸循环固碳途径进行了验证,同时对体外合成5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)的过程进行了优化,提高5-ALA的体外合成量。乙酰CoA是生物体代谢过程中重要的代谢物,也是许多有价值产品合成的前体物质。然而传统途径中通过丙酮酸脱羧生成乙酰CoA碳得率较低,因此构建一条高效的乙酰CoA合成途径具有重要的意义。本研究在体外构建了苏氨酸循环固碳途径合成乙酰CoA,通过分段加酶的方式将其在体外进行了验证。在体外验证时,以丙酮酸为底物,则丝氨酸脱氨酶(TdcB)为循环途径的最后一步反应。结果表明,当加入途径中除丝氨酸脱氨酶之外的酶时,测得的乙酰CoA浓度约1.5mmol/L,待反应达到平衡时,加入丝氨酸脱氨酶,丝氨酸转化为丙酮酸,丙酮酸再次进入循环,乙酰CoA的量增加了约0.2mmol/L,由此得出结论在体外苏氨酸循环实现了固碳。5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulincacid,5-ALA)是四吡咯生物合成的前体,在农业和医学方面有广泛的应用,目前主要通过化学合成和微生物发酵法生产5-ALA。体外多酶催化在生产高价值的化学物质方面是一种很有前途的方法。来自于E.coli的琥珀酰CoA合成酶仅能耐受2mmol/L的琥珀酸,影响了体外合成5-ALA的产量。通过文献查阅筛选出来自于AdvenellamimigardefodensisDPN7T的琥珀酰CoA合成酶,能耐受50mmol/L的琥珀酸。在外界供给ATP时,通过流加琥珀酸和ATP,可以产生130mmol/L的5-ALA。通过六偏磷酸钠再生ATP的情况下,仅流加六偏磷酸钠可以产生23mmol/L的5-ALA,流加六偏磷酸钠的同时流加琥珀酸可以产生40mmol/L的5-ALA。