孕期尼古丁暴露所致子代大鼠肾上腺皮质酮合成功能改变及其宫内起源机制.doc

孕期尼古丁暴露所致子代大鼠肾上腺皮质酮合成功能改变及其宫内起源机制宫内发育迟缓(intrauterinegrowthretardation,1UGR)是最常见的发育毒性之一,不仅引起近期危害(如胎儿窘迫、新生儿窒息和围产儿死亡),而且其危害还将延续到出生后,表现为出生后体格、智力发育落后和成年后代谢综合征易感性增加。孕期母体暴露于烟雾是IUGR发生的最确切诱因之一。尼古丁(nicotine)是烟草中的主要生物碱,因为脂溶性特征,极易通过胎盘在胎儿体内蓄积,影响胎儿发育。孕期尼古丁暴露是导致IUGR发生的重要原因。越来越多的研究表明,下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)轴编程改变是IUGR易发生成年代谢综合征的关键机制。肾上腺是HPA轴的终端效应器官,负责多种甾体激素的合成,对维持正常妊娠、促进胎儿生长和神经系统发育有重要意义。低出生体重所致的肾上腺糖皮质激素(在人为皮质醇,在啮齿类动物为皮质酮)分泌紊乱是出生后代谢综合征易感的主要原因。因此,肾上腺甾体合成功能的编程改变在IUGR成年代谢综合征易感的过程中起到重要作用。本室前期发现,孕期尼古丁暴露可抑制胎肾上腺甾体合成的关键和限速酶—急性调节蛋白(steroidogenicacuteregulationprotein,StAR)和P450侧链裂解酶(cytochromeP450cholesterolsidechaincleavage,P450scc),导致皮质酮合成降低和IUGR发生;细胞实验证实,尼古丁暴露能直接降低原代人胎肾上腺皮质细胞StAR和P450scc表达及皮质醇合成。提示,胎肾上腺是尼古丁暴露的毒性靶器官,尼古丁对肾上腺有直接毒性作用。然而,尼古丁如何影响IUGR胎肾上腺皮质酮合成具体机制还不清楚,尼古丁暴露的IUGR胎儿出生后各时期肾上腺甾体合成酶系统及功能如何改变也未见相关报道。类固醇合成因子-1(steroidogenicfactor-1,SF-1)在肾上腺皮质形态发生和类固醇激素合成基因转录调控方面均发挥重要作用,所有甾体合成酶基因的启动子区均存在SF-1识别序列。研究证实,尼古丁暴露可引起DNA甲基化和/或组蛋白乙酰化改变,导致基因表达异常。DNA甲基化抑制剂或组蛋白去乙酰化抑制剂可以降低SF-1表达而影响甾体激素的分泌。另一方面胰岛素样生长因子1(insulin-likegrowthfactor1,IGF-1)及其受体IGF-1R广泛表达于肾上腺皮质,可通过磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(proteinkinaseB,Akt)通路调节SF-1及相关甾体合成酶系统的表达,促进甾体激素的合成。提示,尼古丁暴露可能通过影响肾上腺IGF-1信号通路或SF-1表遗传修饰及表达,改变胎肾上腺甾体合成酶的表达,从而编程肾上腺皮质酮的合成功能。本研究在孕期尼古丁暴露所致的大鼠IUGR模型上,系统观察了出生前、出生后正常或高脂饮食下,胎肾上腺SF-1表达、甾体合成酶系统、IGF-1信号通路以及肾上腺皮质酮水平变化；进一步从SF-1启动子区DNA甲基化和组蛋白乙酰化修饰角度,证实尼古丁所致胎肾上腺甾体合成酶表达改变的表观遗传机制。本研究对于全面认识尼古丁的发育毒性,指导孕期健康生活,降低IUGR出生率及成年慢性疾病易感性,提高人口质量,具有重要的理论价值和现实意义。第一部分孕期尼古丁暴露所致胎肾上腺皮质酮合成功能抑制目的：利用整体动物实验,研究孕期尼古丁暴露对胎肾上腺的甾体合成酶系统基因表达、IGF-1信号通路以及皮质酮合成功能的影响,并从SF-1的DNA甲基化和组蛋白修饰角度,探讨其表达调控机制。方法：受孕大鼠随机分为对照组和尼古丁组,孕11日(gestationalday1,GD11)皮下注射2mg/kg-d(每天分两次注射),建立孕中、晚期尼古丁暴露所致大鼠IUGR模型,气质联用分析仪检测母鼠和胎鼠血中尼古丁含量；苏木精-伊红染色和透射电镜观察肾上腺组织和细胞病理学变化；酶联免疫吸附(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)技术检测胎肾上腺内生皮质酮和血IGF-1含量；实时定量PCR技术检测胎肾上腺StAR.P450scc,3p羟类固醇脱氢酶(3β-hydroxysteroiddehydrogenase,3βHSD)、类固醇11β-羟化酶(steroid11β-hydroxylase,P450c11)、类固醇21-羟化酶(steroid21-hydroxylase,P450c21)、SF-1、IGF-1信号通路(1GF-1、IGF-1R、AKT1)、黑皮素受体2(melanocortinrecepto