磷酸化蛋白质组学的研究及其应用.pdf

磷酸化蛋白质组学的研究及其应用蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式。近年来，蛋白质组学技术的发展和应用为磷酸化蛋白质的定性、定量和功能研究提供了必要的技术。这使得大规模和系统性进行磷酸化蛋白质研究成为可能。本文综述了检测和鉴定磷酸化蛋白质的蛋白质组学方法及其在生命领域的应用前景。2.生物组学研究方法在对疾病发病机制、诊断、生理功能及药物开发研究中，往往需要获取一些高通量、大样本、全局性数据。通过整体化系统性分析，从中寻找线索，推断可能的病因以及诊断靶标，由此诞生了诸如基因组学、蛋白质组学及代谢组学等建立在网络架构式研究思路基础上多种新的研究方法和理论。3.蛋白质磷酸化修饰生物体能迅速对体内环境变化和外界环境刺激产生应答反应，这些反应过程靠复杂的调控机制调节。其中大多数调控机制是由蛋白质的构象变化所介导的，而蛋白质本身的构象变化常常是通过变构效应和蛋白质一级结构上发生的各种共价修饰来实现的。目前已经发现了20多种蛋白质翻译后修饰，以至一种基因产物可呈现磷酸化修饰、糖基化修饰、羧基化修饰、乙酰化修饰以及连接变异体等多种形式。4.蛋白质磷酸化修饰的重要性蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性，以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受成为一种最普遍的调控手段。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程，几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、细胞骨架调控、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩、新陈代谢及肿瘤发生等生命活动的所有过程。并且可逆的蛋白质磷酸化是目前所知道的最主要的信号转导方式。目前已经知道有许多人类疾病是由于异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。5.磷酸化蛋白质组学的研究磷酸化蛋白质组学的研究尚处于初期阶段。鉴于其特殊的研究方法及内容，对揭示生命体尤其是疾病状态下细胞信号传导具有不可替代的优势。此外，磷酸化蛋白质组学的研究为寻找药物新的作用靶点和疾病诊断指标提供全新的研究思路。本文就磷酸化蛋白质的检测、定量技术及其在生物领域的研究进行综述。蛋白质磷酸化在生命系统中扮演着重要角色，是真核细胞信号转导的核心。在真核生物中，丝氨酸磷酸化最多，苏氨酸磷酸化次之，而酪氨酸磷酸化最少。磷酸化蛋白质组的正确解析及磷酸化位点的确定是其主要任务之一。此外，蛋白质磷酸化是一个动态的过程，不同条件下蛋白质磷酸化的定量分析是差异蛋白质组学研究的重要内容。2.磷酸化蛋白质的主要检测技术2.1放射性标记法放射性标记法是研究蛋白质磷酸化的传统方法。该方法将用放射性同位素P标记的磷酸化蛋白质，经过分离、富集，利用放射自显影技术进行磷酸化蛋白质的检测。如果要进一步分析磷酸化位点，则需要通过蛋白酶解消化，再通过Edman降解或质谱对肽段进行测序。该方法具有直接、灵敏度高的特点。但由于存在有放射性污染，磷酸化、脱磷酸化的速率易受多种因素包括孵育时间等的影响，且磷酸化、脱磷酸化变化慢而管家蛋白质的磷酸化不易测出，不能进行组织标记等局限性，故极大地限制了它的应用。2.2免疫印迹与免疫沉淀法免疫印迹与免疫沉淀法是常用的分析方法。该方法是将蛋白质电泳分离后，用抗磷酸化氨基酸抗体与磷酸化蛋白质进行免疫印迹反应来检出磷酸化蛋白质。抗酪氨酸磷酸化抗体特异性较好，也最为常用。由于磷酸化蛋白质含量很低，如果先用免疫沉淀对磷酸化蛋白质进行富集，这样可以降低非磷酸化蛋白质的干扰，提高检测的准确性。随着抗体制备技术的改进，也有研究人员已经尝试用类似方法对丝氨酸和苏氨酸磷酸化蛋白质进行研究。但是该方法也存在一定的局限性，如多检出高丰度蛋白质，需要大量的样品，抗体并非绝对专一性，许多非磷酸化蛋白质会出现假阳性结果。2.3荧光检测法荧光检测法是一种新兴的检测方法。该方法利用荧光标记的抗体与磷酸化蛋白质结合，通过荧光检测器检测荧光强度来确定磷酸化蛋白质的存在。该方法具有高灵敏度、高分辨率、高通量的特点，可以同时检测多个磷酸化位点。但是，该方法也存在一些局限性，如荧光标记的抗体价格昂贵，需要高昂的设备费用，且可能会受到自发荧光的影响。Pro-QDiamond是XXX新推出的一种荧光染料，用于检测磷酸化蛋白质。它可以直接在荧光扫描仪上显示出凝胶电泳胶上分离的磷酸化蛋白质，对非磷酸化蛋白质的反应性很低。荧光强度随着蛋白质磷酸化程度的不同而呈现出一定的量的变化，在500～1000倍浓度范围内荧光染色的线性反应实现严格定量改变。因此，该染料可用于磷酸化蛋白质的差异表达谱方面的研究。此外，该染料可以与其他检测总蛋白的荧光染料配合使用，进行磷酸化蛋白质的定量。但是，它对于磷酸化程度不同的磷蛋白检测的灵敏度不同，不能检测出体内所有的磷酸化蛋白质。鉴定磷酸化蛋白质的最基本手段是质谱技术，目前多采