长期施肥对土壤水解酶活性的影响.docx

长期施肥对土壤水解酶活性的影响杜文钊研究意义：施肥是影响土壤质量演化及其可持续利用最为深刻的农业措施之一。过去人们关于施肥对土壤物理、化学性质及其环境的影响效应做了大量研究。近20年来，土壤的生物学特性在土壤肥力与质量中作用的研究得到不断加强。前人研究认为施用有机肥料可以显著地提高土壤微生物量碳、氮的含量以及土壤酶活性，并且随着有机肥施用量的增大，效果越明显。施用化学肥料也有提高土壤微生物量的效应，但过量的施用化肥(氮磷钾)，降低了土壤微生物量碳的含量。但前人的研究大多集中在施用化肥或有机肥对一种或两种土壤微生物学指标的影响，而在我国系统的研究长期施用化肥、有机肥、秸秆还田以及轮作等措施对土壤生物量、土壤呼吸和土壤酶活性等多种土壤生物学指标影响较少，特别是以长期试验为平台，研究长期撂荒与种植作物对土壤微生物学特性的影响更少。因此本次实验是研究长期肥制度对土壤生物学特性的影响，为建立合理施肥制度，提高土壤质量和实现土壤可持续利用提供理论依据。土壤酶是由微生物，动植物活体分泌及由动植物残体，遗骸分解释放于土壤中物质，能量代谢旺盛程度和土壤质量水平的一个重要生物指标。土壤水解酶是催化土壤中各种底物发生水解反应的酶类，通过裂解有机化合物中糖苷键，脂键，肽键，酸酐键以及其他键，直接参与土壤中有机物的转化。土壤水解酶测定方法：茚三酮比色法。试剂：甲苯，白明胶，甘氨酸，浓硫酸，硫酸钠，茚三酮仪器：分光光度计，50ml三角瓶，50ml容量瓶，恒温培养箱或水浴锅试剂配制：1磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)配制：a：0.2mol磷酸二氢钠溶液：称取27.6gNaH2PO4·H2O溶至1L，0.2mol磷酸氢二钠溶液：53.65gNa2HPO4·7H2O或71.7gNa2HPO4·12H2O溶至1L；取19ml0.2mol磷酸二氢钠溶液加81ml0.2mol磷酸氢二钠溶液，稀释至200ml。2.1%白明胶溶液：称取1g白明胶用磷酸盐缓冲液溶至100ml；0.05mol/L硫酸：将1ml浓硫酸（比重1.84）稀释至360ml。3.2%的茚三酮溶液：称取2g茚三酮溶于100ml丙酮中为原液，使用时将95ml原液加1ml乙酸和4ml蒸馏水混合制成工作液(该工作液不稳定，现用现配)。4.20%硫酸钠溶液：称取20g硫酸钠用蒸馏水溶至100ml。5.甘氨酸标准液：称取100mg甘氨酸用蒸馏水溶至1L(100微克/ml)。步骤：2g土样两份置于三角瓶，加0.5ml甲苯，混匀放置15min，另取一三角瓶不加土样和甲苯作为无土对照；将其中一土样试管加10ml1%白明胶，另一瓶加10ml蒸馏水代替明胶溶液作为无基质对照。盖好瓶盖，小心摇匀，在30摄氏度恒温水浴锅培养24h后过滤；吸取滤液5ml于试管中，加0.5ml0.05mol/L硫酸和3ml20%硫酸钠沉淀蛋白质，再次过滤；取滤液2ml加1ml2%的茚三酮溶液在试管中，于沸水浴上加热10min，将显色液稀释至50ml。560nm比色测定甘氨酸标准曲线的制作：分别吸取0、0.1、0.2、0.5、1.2和5ml甘氨酸标准液置试管中，加蒸馏水至5ml，各加入1ml2%的茚三酮溶液摇匀，在沸水浴上加热10min，将显色液转入50ml容量瓶，稀释至刻度，560nm以不含甘氨酸的溶液为对照比色测定。用干热灭菌的土壤和不含土壤的基质（如石英砂）作对照，方法如前所述，以除掉土壤原有的氨基酸引起的误差。换算成甘氨酸的量，根据用甘氨酸标液制取的标准曲线查知。标准曲线绘制：分别吸取0、1、3、5、7、9、11mL该工作液于50mL容量瓶中即获得甘氨酸浓度分别为0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2μg•mL-1的标准溶液梯度，然后加入1mL2％茚三酮溶液。冲洗瓶颈后将混合物仔细摇荡，并在煮沸的水浴中加热10min。将获得的着色溶液用蒸馏水稀释至刻度。在560nm处进行比色，最后绘制标准曲线。结果计算：土壤水解酶的活性，以24h后1g土壤中甘氨酸的微克数表示。甘氨酸（μg•g-1）＝﹙c×50×ts﹚／m甘氨酸（μg•g-1）－24小时后1g土壤中甘氨酸的微克数；c－标准曲线上查得的甘氨酸浓度，μg•mL-1；50－显色液体积，mL；ts－分取倍数（这里是2＝10/5）；m－土壤质量，g