植物细胞骨架的光学显微镜观察.doc

几种不同类型显微镜的使用及其对胞质环流的观察一、实验目的学会使用相差显微镜，掌握暗视野技术，以及荧光显微镜等技术二、实验原理在活细胞中，原生质流动是细胞活力强弱的重要标志，它的产生与细胞中微丝的作用是密不可分的。微丝的纤维较细，直径为5－6nm，主要成分是肌动蛋白、肌球蛋白和原肌球蛋白，并像肌肉一样有收缩功能。微管是由一种叫做微管蛋白的蛋白质组成的，位于原生质（静止的）外质，紧靠在质膜之下，离运动的内质至少有1µm的距离，与胞质川流运动无关，主要起保持细胞形状、承担细胞运动和细胞内物质运输的作用。另外，用秋水仙素与细胞松弛素B处理也可产生不同的结果。经秋水仙素处理后，细胞的纤维被扰乱，但不影响川流运动，这是与秋水仙素影响边缘微管作用有关。相反，用细胞松弛素B处理，就可抑制细胞的川流运动，很明显，微丝担负着川流运动的功能。胞质环流需要消耗能量，也受温度、渗透压以及离子浓度的影响。三、实验材料新鲜洋葱鳞茎，刚毛藻等。四、实验器材相差显微镜，普通光学显微镜，黑卡纸，载玻璃片，盖玻片，镊子，吸水纸，剪刀，滴管，擦镜纸。五、实验药品100µg/ml秋水仙素溶液，20µg/ml细胞松弛素B(cytochalasinB)，蒸馏水，香玻油，二甲苯。六、实验步骤取新鲜洋葱鳞茎内表皮约1cm2或更小，放在干净的载玻片上，加一小滴水，将盖玻片倾斜盖上，并注意不出现气泡，即制成水封片。取一块黑纸，把它剪成暗视野显微镜用的遮光板，并放入普通光学显微镜的聚光器下的光阑上，制成暗视野显微镜。（须反复调整遮光板的尺寸以得到最佳效果）。把制成的水封片放在暗视野显微镜下用10倍物镜观察，可以看到在明亮的细胞壁与半透明的细胞核之间有很多极小而明亮的“质点”或颗粒，仔细观察，可以看出这些正作有向的运动（速度很慢），水封片中多加些水会促进这种运动。学习相差显微镜，荧光显微镜和倒置显微镜的使用方法和有关操作技术。植物细胞骨架的光学显微镜观察一、实验目的掌握细胞染色的基本过程及非切片法制片技术，了解细胞骨架的结构，学会制作永久封片。二、实验原理当用适当浓度的TritonX—100处理细胞时，因其非离子型表面活性剂的特性，可以除去可溶性蛋白质和脂类，而微丝束属不可溶性蛋白，就不会被TritonX—100破坏而保留在细胞中。当用考马斯亮蓝R250染色时，在光学显微镜下通常能观察到以核为中心的纤维状骨架，在质膜下还能见到丝状骨架，骨架上常附着一些与膜运动、整合有关的蛋白质。考马斯亮蓝R250并不是特异地显示微丝，但由于有些细胞骨架纤维如微管等在该实验条件下不够稳定，又因有些类型的纤维太细而在光学显微镜下无法分辨，因此看到的是由微丝组成的纤维束，直径约在40nm左右。三、实验材料新鲜洋葱鳞状叶。四、实验器材普通光学显微镜，50ml烧杯，滴管，试剂瓶，载玻片，盖玻片，镊子，染色板，吸水纸，擦镜纸。五、实验药品1．M—缓冲液：所含各成分终浓度为50mmol／L眯唑，50mmol／LKCL，0.5mmol／LMgCl2，lmmol／LEGTA(乙二醇双(α—氨基乙基》醚四乙酸)，0.1mmol／LEDTA，lmmol／L巯基乙醇或二硫苏糖醇<DTT)。lmol／LHCl调pH到6.820.01mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)用0.2mol/L磷酸氢二钠一磷酸二氢钠缓冲液稀释配制其中磷酸盐缓冲液配法：0.2mol/LNa2HPO449ml0.2mol/LNaH2PO45lml3.1％TrltonX—100，用M—缓冲液配制。4．0.2％考马斯亮蓝R250。配制用的溶剂为：甲醇：冰醋酸:水(46.5：7：46.5)。·5.3％戊二醛溶液，用9.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)配制6.50％，70％，95％乙醇。7.叔丁醇8.正丁醇9.二甲苯。10.中性树胶。六、实验步骤1.撕取洋葱鳞状叶内表皮约lcm大小，取若干片，置于装有pH6.8磷酸盐缓冲液的50ml烧杯中，用镊子轻按入使其浸没5min。2．吸去磷酸盐缓冲液，用l％TritonX—100处理20—30min。3.吸去TrironX—i00液，用M-缓冲液洗3次，每次10min左右。4.用3％戊二醛固定0.5h。5.再用磷酸盐缓冲液洗3次，每次10min。6.0.2％考马斯亮蓝R250染色20—30min（在染色板上）。7.用蒸馏水洗1—2次，将样品置于载玻片上，在普通光学显微镜下观察，先低倍，再高倍，最后用油镜。8.如观察结果较佳，可制作永久封片：在有样品的50ml烧杯中，依次用如下试剂处理:50％乙醇，70％乙醇，95％乙醇，(1/2)V95％乙醇+(1/2)V叔丁醇，叔丁醇(以上每个步骤反应5—10min)或正丁醇，正丁醇，二甲苯，二甲苯(每个步骤5—10min)。然后，将样品置于载玻片上展开，镜检后滴一滴中性树脂，盖上