动物源性饲料中骆驼源性成分定性检测方法PCR方法.doc

动物源性饲料中骆驼源性成分定性检测方法PCR方法IdentificationofCamelidaederivedmaterialsinanimal-on梦natedfeedstuffs-PCRmethod本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人:陈颖、吴亚君、徐宝梁、王晶、曹际娟、高宏伟、宗卉、黄文胜、袁飞、赵贵明。本标准首次发布。1.范围本标准规定了动物源性饲料方法，该检测方法的检出限为0.工%(质量分数)。本标准适用于动物源性饲料成分中骆驼源性成分的的定性检测。2.规范性引用文件5试剂和材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂口实验用水符合G13}E82的要求口5.丁骆驼源性成分检测用引物(对)序列为:F:}'-AGCCZ'TC.TCTTCAC}TCGCACAC-3’R:a'-GCCCATGAAAGCTGTTGCT一3’5.2TaqL3}fA聚合酶(Tuq,Thermusaq}aticu，水生栖热菌)。5，3限制性内切酶.TuqI酶。5.aa}TPS:dATPCdeoxyadenosinetphate，脱氧胸昔三磷酸),dCTP(deoxycytidinetriphosphate，脱氧胞昔三磷酸)、dGTP(deoxyguanosinetriphosphate，脱氧鸟昔三磷酸)。5.5琼脂糖:电泳纯。5.6澳化乙锭。5.7三氯甲烷。5.8无水乙醇。5.970%乙醇。5.10DNA分子量标准品(10aby一800bp)(bp;basepair,碱基对)口5.11裂解液;1写CTAB(cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基滨化按)，0.05mol/LTris-HCI(pH8.0)[Tris-;tris(hydroxymetlzyl)axninomethaxae，三(经甲基)氨基甲烷},0.7mol/LNaCI,0.01mol/LEDTA(pHB.0)(ethylenediaxxiinetetraaceticacid，乙二胺四乙酸)。5.12TE缓冲液(Tris-HCI,EDTA缓冲液):10mmol/LTris-HCl(pHB.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)。5.13l0XPCR缓冲液:100mmol/LI}C1,160mmol/L(NH4)ZS04,20mmol/LMg50},200mmol/LTris-HCl(pHB.8),l0aTritonX-100(t-octylphenoxypolyethoxyethanol，辛基苯氧基聚乙氧乙醇)，1mg/mLBSA(bovineserumalbumin，牛血清蛋白)。5.14电泳缓冲液:Tris54g,硼酸27.5g,0.5mol/LTE缓冲液(pHB.0)20mL，加蒸馏水至1000mL;使用时10倍稀释。5.15澳化乙锭贮存液:用水配制成10mg/mLo5.16加样缓冲液:。.2500澳酚蓝，4000(质量浓度)蔗糖水溶液。5.i7酶切缓冲液:10mmol/LTris-HCl(pH7.5),10mmol/LMgClz,50mmol/LNaC1,0.1mg/mLBSAo6仪器设备DNA热循环仪。核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。恒温水浴锅。离心机:离心力12Ooa}a微量移液器(0.5p.L^}10p.L,10}L^-100pL,10}L^"200pL,I00uL-}1000pL)。电泳仪。紫外检测仪。pH计。天平:感量0.0Igo1八J乙勺︺，心.尸O月﹄U口U尸O6.56.66.76.86.97试样选取与制备按照GB/T14699.1采样，将实验室样品粉碎，充分混合均匀后待用。8检验步骤8.1样品的总DNA提取样品粒度100目时最少称取50mg;fi0目时最少称取100mg;20目时最少称取200mga称取样品于微量离心管中，加人600}cL^-800}.L裂解液，“℃3h，期间不时振荡混匀;I2000g离心5min，转移上清于洁净离心管中，加等体积酚，混匀;12000g离心5min，转移上清于洁净离心管中，加等体积三氯甲烷+异戊醇(24+I),混匀;I2000g离心5min，取上清液;加2倍体积冰预冷的无水乙醇，-20℃沉淀Ih;12000g离心5min，弃上清液;70%乙醇洗涤一次，晾干;加人50}.LTE,溶解riphnsphate，脱氧腺昔三磷酸)、dTTP(deoxythymidinetriphos-沉淀口也可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA08.2DNA浓度和纯度的测定取5}