总氮量的测定.doc

总氮量的测定微量凯氏（Mirco-Kjeldahl）定氮法一、目的1、学习微量凯氏定氮法的原理2、掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括标准硫酸铵含量的测定，未知样品的消化、蒸馏、滴定及其含氮量的计算等。二、原理凯氏定氮法常用于测定天然有机物（如蛋白质，核酸及氮基酸等）的含氮量。天然的含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此时程称之为“消化”。但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。甘氨酸的消化过程可表示如下：NH2浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氮，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量，一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨与溶液中的氢离子结合，生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低。然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的当量数（相当于待测物中氨的当量数）计算出待测物中的氮量。滴定时用甲烯蓝和甲基红混合指示剂，其指示范围为pH5.2~5.6，将NH4H2BO3的蓝色滴至原来H3BO3的蓝紫色即为终点。本法适用范围0.2~1.0毫克氮。相对误差应小于2%。三、材料、试剂与器具（一）材料人的血清或猪的血清（二）试剂1、浓硫酸（化学吨）2、30%氢氧化钠（分析纯）溶液3、0.9%NaCl溶液4、硫酸钾—硫酸铜混合物：硫酸钾与硫酸铜（CuSO4、5H2O）以3：1（W/W）的配比混合研磨成粉末。5、2%硼酸6、混合指示剂的配制：方法一：取50毫升0.1%甲烯蓝无水醇溶液与200毫升0.1%甲基红无水乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶备用，这种指示剂酸性时为紫色，碱性时为绿色，变色范围窄且灵敏。方法二：0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10毫升与0.1%甲基红乙醇溶液2毫升混和即成。本指示剂的变色范围为紫红色灰色绿色7．0.0100MHCl8.硼酸一指示剂混合液：取100毫升2%硼酸溶液，滴加混合指示剂贮备液，摇匀后溶液呈现紫红色即可。（约加1毫升左右混合指示剂）9.标准硫酸铵溶液（0.3毫克氮/毫升）（三）、器具凯氏烧瓶消化架吸量管（1毫升、2毫升）量筒（10毫升）凯氏定氮蒸馏装置微量滴定管（3毫升、5毫升，可读至0.02毫升）锥形瓶（50~100毫升）容量瓶（50毫升）四、操作步骤（一）样品的处理血清样品：取人血（或猪血），放于离心管中，于冰箱中放置过液，次日离心除去凝血块，上层黄色透明清液即为血清。准确吸取血清1.0毫升加入0.9%NaCl4.0毫升，仔细混匀备用。固体样品：某一固体样品中的含氮量是100克该物质（干重中所含氮的克数）来表示（%）。因此在定氮前，应将固体样品中的水份除掉。一般样品干燥的温度都采用105℃，因为非游离的水都不能在100℃以下烘干。在称量瓶中称入一定量的磨碎的样品，然后置105℃的烘箱内干燥4小时。用坩埚将称量瓶放入干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。每干燥1小时后，称量一次，直到两次称量的数量不变，即达恒重。（二）消化取2个50毫升的凯氏烧瓶，向第一号烧瓶内加2毫升稀释血清溶液（或4毫升核酸制品溶液，或200毫克固体粉末）。注意，用吸量管直接将溶液（或用试管加入固体样品）加至烧瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶颈上，向2号烧瓶加入2毫升水作空白对照。在每个烧瓶内加入硫酸钾—硫酸铜混合物约0.2克，浓硫酸3毫升，小瓷片两粒，摇匀。将烧瓶约60度角固定在铁架上，每个瓶口放一小漏斗，在通风厨内的电炉上消化。在消化开始时，应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明绿色为止。消化完毕，待烧瓶内容物冷却后，加蒸馏水10毫升（注意慢加，边加边摇）。冷却后将瓶内容物转入50毫升的容量瓶中，并用蒸馏水洗烧瓶数次，溶液一并倒入容量瓶，最后定容至刻度摇匀，做上记号备用。（三）蒸馏1、仪器的洗涤：仪器应先经一般洗涤，再经水蒸气洗涤。蒸馏器（图1-1）有几种，应用前需熟悉其使用方法。使用方法如下：图1-1凯氏微量定氮蒸馏装置开放自来水龙头，使水E进入G，从K管流出（水不宜开得过大以免水从G管溢出）。开放P3，使水进入A室，漏斗D中加蒸馏水约10毫升入B室。用拇指将管口按紧，同时开放P1，则B室中的水先从Y型管口冲出，随后A室中水经K管流出，一般情况下如此重复洗涤两次即可。若蒸馏器内有氨存在，则应加入蒸馏水后，不加样品蒸馏一次方可使用。（可用PH试纸检查。）A为蒸气发生室，P3为其开关，P1为出水开关，B为蒸馏室，与出气室M相遇，M管插入盛有定量酸液的锥形瓶，B室内有Y型管，一端与A室相通，另一端经P4与漏斗D相连，可经此将样品及试剂加入B室，F为指形冷凝管，E为进水管，水经F、G、K而