植物原生质体的制备及融合.pdf

植物原生质体的制备及融合生64范泓洋20060300032008.3.27一、实验目的：a)学习植物原生质体的分离制备技术，观察原生质体形态。b)学习植物原生质体的融合技术，观察融合原生质体时其形态及变化。二、实验原理i.PEG融合：利用PEG介导的动物细胞融合，其实验原理到目前为止还没有完全定论。学者们一般认为，PEG改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相临的重排质膜在修复时相互合并在一起,使两细胞的胞质沟通,从而造成相互接触的细胞之间发生融合。现在的流行的假设有两种：一种时说PEG分子吸附在膜的表面，通过长分子的牵拉和吸附作用使原生质表面间形成分子桥面聚集；还有一种假设是说PEG分子在膜表面的耗减，或者说脱离，产生的范德华力使细胞聚集以致融合。近来的一些实验通过对水溶液和PEG溶液中膜表面的粘滞性的精确测量指出在PEG中细胞表面的粘滞性更接近水溶液中的，而并非大量PEG中，由此间接支持了第二种假设。但是个人认为，这个假设是否成立还有待于更直接的实验证据。PEG法将病毒法诱导产生杂交细胞的频率由10-5提高到10-3。PEG诱导细胞融合的效果,同其相对分子质量大小及浓度高低、作用时间、PH值密切相关。PEG相对分子质量、浓度增大,促进细胞融合的能力提高了,但它对细胞的毒性也随之增大,故通常选相对分子质量在1000-6000,浓度在30%-50%的PEG,并且严格控制PEG的作用时间,减少它对细胞的毒性,PH值一般选在7.4--8.0之间。现在采用PEG时,一般是同时采用高pH值，高Ga2+浓度的溶液来促进细胞膜融合,或加入二甲基亚砜(DMSO)来提高PEG诱导细胞融合。特别是在低相对分子质量和较低浓度的PEG中,DMSO的效果更加突出。三、实验用品：仪器：显微镜、低速台式离心机、水浴锅；直式漏斗、离心管；眼科镊、300目尼龙网、10ml离心管、载玻片、小平皿试剂：洗涤液、酶混合液、PEG溶液、高Ca，高pH洗涤液、蔗糖溶液（20%）实验材料：剑兰花瓣四、实验步骤：a)原生体的制备i.将新鲜花瓣用蒸馏水洗干净，用滤纸吸干表面水分。ii.用尖头镊剥去木料的下表皮或将其剪成小细条，加入几滴酶液恒温振荡半小时。iii.酶解好的原生质体混合液经300目尼龙网过滤到10ml离心管，加入少量洗涤液定容至4ml，此时，未被酶解的大块组织留在尼龙网上。iv.500rpm离心5分钟，弃去上清液，加洗涤液至约2ml吹打均匀。500rpm5min重复离心一次，彻底去除酶液。v.加5滴洗涤液，悬浮原生质体。vi.镜检，检察原生质形态和浓度，看看是否有碎片，本试验中碎片较少，故未做蔗糖漂浮。b)PEG融合：i.在小平皿内各滴三滴原生质体悬液，静臵沉淀。ii.各缓缓滴加一滴PEG在其中两滴原生质体悬液上，iii.在另一滴上滴加一滴高Ca2+高pH洗液。iv.镜下观察，1-2分钟后，在原先加入PEG的一滴悬液上加入一滴高Ca2+高pH洗液。v.镜检，记录结果。五、实验结果：（见附图）六、实验讨论：a)关于其他融合技术的讨论：物理融合技术：现在常用的物理融合技术有电融合与激光融合技术。i.电融合：Zimmermann在1978年首先采用电脉冲方法成功地诱导了细胞融合,开创了细胞融合技术的新局面。它实现了装臵化,比病毒法,化学法操作起来方便些,物理参数易精确测量,重复性较好的优点。电融合法的过程可分为两步:①电介质电泳。在电融合槽的电极上输出一个正弦交流电,形成一个非均匀电场,细胞在非均匀电场中被极化,形成偶极子,细胞向高场强区移动。极化细胞在电介质电泳下相互接近时,由于偶极子相互作用,相互吸引,所以细胞在融合槽中排列成珠链状。为了形成细胞珠链,必须选择合适的交流电场强度,使细胞所受电场力大于引起布朗运动的随机力,为此,Schwen和Sher进行了理论分析,得出该电场强度的阈值。②瞬时可逆击穿细胞排成珠链状后,在电极上输出单个或多个方波脉冲。使细胞膜上产生可逆性小孔,导致细胞融合。关于电脉冲融合细胞机理,Zimmermann认为电融合过程的分子机制是:通过电泳,两细胞膜紧密接触,且膜表面的蛋白质分子分离,产生了无蛋白的类脂区。电脉冲作用时引起膜结构局部扰乱,出现小孔洞。而相对的脂双层间分子在范德瓦尔斯作用力下,形成脂分子桥,由于连接处的细胞膜表面曲率大,处于高张力状态,在热力学上是不稳定的,所以最终导致两细胞逐渐融合成一个圆形的大球状细胞。但SubrataBiswas于1999年报道,通过扫描电子显微镜(SEM)观察到两细胞膜间有膜突起物,细胞膜就是依靠这些微伸出物连接起来的,并没有观察到微小孔洞的存在。图1：电融合过程示意图。化学融合：现在普遍应用