畜肉中卡拉胶的测定(BJS201804).docx

—10————8—附件畜肉中卡拉胶的测定（BJS201804）范围本方法规定了生、鲜肉中卡拉胶的液相色谱-串联质谱测定方法。本方法适用于生鲜肉、冷却肉、冻肉中卡拉胶的定量测定。原理样品经匀浆后，用盐酸溶液处理，其中的卡拉胶降解生成特征性寡糖，用液相色谱-串联三重四极杆质谱检测寡糖含量，外标法定量。试剂和材料本方法所用水为符合GB/T6682规定的一级水。试剂3.1.1乙腈（CH3CN）：色谱纯。3.1.2甲酸铵（HCOONH4）：色谱纯。3.1.3盐酸（HCl）：优级纯。试剂配制10mM甲酸铵水溶液：称取甲酸铵（3.1.2）0.63g，用水溶解并定容至1000mL。标准品卡拉胶：食品添加剂级。标准储备液的配制称取卡拉胶0.1g（精确至0.1mg），用60℃温水溶解，转移至10mL容量瓶中，冷却至室温后，用水定容至刻度。此溶液浓度为10mg/mL，现用现配。仪器和设备高效液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI源）。分析天平：感量为0.0001g。分析天平：感量为0.01g。离心机：转速≥4000r/min。涡旋混合器。食品粉碎机。匀浆机。恒温水浴。试样制备和保存依据GB/T9695.19-2008规定的方法取样。样品剔除脂肪组织，瘦肉部分（＞100g）用食品粉碎机（4.6）粉碎混匀。混匀好的样品分成两份，分别作为试样（＞50g）和留样（＞50g），装入洁净容器中，密封并标记，于-18℃保存。试样处理6.1基质加标工作液称取4份打碎混匀的空白基质（确定不含卡拉胶的畜肉）各10g（精确至0.01g）于50mL离心管中，分别加入标准储备液（3.4）0.1mL，0.2mL，0.3mL，0.4mL，加入水使液体的总体积为23mL，10000rpm匀浆1min，加入2mL盐酸（3.1.3），加盖后涡旋30s，置于80℃水浴中20min，每10min取出振摇一次。取出冷却后，4000rpm离心5min，取上清液1mL，用乙腈1:1稀释后，过滤膜（0.22m,有机相），待测。6.2样品待测液称取10g试样（精确至0.01g）于50mL离心管中，加入23mL水，10000rpm匀浆1min，加入2mL盐酸（3.1.3），加盖后涡旋30s，置于80℃水浴中20min，每10min取出振摇一次。取出冷却后，4000rpm离心5min，取上清液1mL，用乙腈1:1稀释后，过滤膜（0.22m,有机相），待测。测定7.1参考液相色谱条件7.1.1色谱柱：BEHAmide柱（粒径1.8μm，2.1mm×50mm），或性能相当者；7.1.2进样量：5µL；7.1.3柱温：30℃；7.1.4流速：0.3mL/min；7.1.5流动相：A相：10mM甲酸铵水溶液（3.2）；B相：乙腈（3.1.1）。梯度洗脱程序见表1。表1梯度洗脱程序时间/minA相/%B相/%0.0020803.0060405.0060405.5020808.0020807.2参考质谱条件7.2.1离子化方式：电喷雾电离；7.2.2扫描方式：负离子扫描；7.2.3检测方式：多反应监测（MRM）。雾化气、鞘气、碰撞气均为高纯氮气或其他合适气体，源内裂解电压（fragmentorVoltage）、碰撞能量（CE）等参数使用前应调节，使质谱灵敏度达到检测要求，参考条件详见附录A。监测离子对信息参见附录A中的表A.1和附录C中的表C.1。7.3定性测定在相同实验条件下测定基质加标工作液和样品待测液，若样品溶液中检出色谱峰的保留时间与相应基质加标工作液色谱峰的保留时间一致，且样品溶液的质谱离子对相对丰度与浓度相当基质加标工作液的质谱离子对相对丰度相比较，相对离子丰度（k）的相对偏差不超过表2规定的范围，则可判定样品中存在卡拉胶。表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度（%）k>50%50%≥k>20%20%≥k>10%k≤10%允许的相对偏差（%）±20±25±30±507.4定量测定以基质加标工作溶液中含卡拉胶的质量为横坐标，以定量离子的峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线。按外标法计算得到待测样品中卡拉胶的含量。在上述色谱和质谱条件下，基质加标工作液的卡拉胶降解产物提取离子色谱图见附录B中的图B.1。7.5空白试验除不加试样外，均按样品待测液（6.2）同法操作。结果计算结果按下式计算：式中：X—试样中卡拉胶的含量，单位为克每千克（g/kg）；m—由基质加标工作曲线计算出的供试品溶液中卡拉胶的含量，单位为毫克（mg）；M—试样的质量，单位为克（g）。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字。9方法精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15％。10方法检出限和定量限本方法对卡拉胶检出限为0.02g/kg；定量限为0.06