细菌普通染色和革兰氏染色(0001).doc

细菌普通染色和革兰氏染色生命科学学院生02孙禹2010012376实验日期：2012-3-12同组姓名：张宇成一、实验目的1、掌握细菌涂片标本的制备方法和普通染色的步骤2、掌握革兰氏染色法的操作步骤和关键点3、识别细菌的革兰氏染色结果4、学习无菌操作技术二、实验原理本次实验的主要内容是学习革兰氏染色方法。这一方法由丹麦病理学家ChristainGram于1884年创立，通过革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类。这也是鉴别菌种的重要方法。革兰氏染色的原理主要是由于不同细菌细胞壁的结构不同所致：革兰氏阳性菌(G+)：细胞壁肽聚糖较厚，媒染剂可以和结晶紫形成复合物保存在细胞内，且经乙醇处理细胞壁孔径减小，难被番红再次染色，因而呈现紫色。革兰氏阴性菌(G-)：肽聚糖层很薄，脂肪含量高。乙醇能够使细胞壁更加疏松，且通透性增加。因而结晶紫颜色容易被脱去，经番红染色后呈现红色。另外，酵母菌也可被染色，且呈现革兰氏阳性结果。图一革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌细胞壁差异示意图对比项目占细胞壁的干重(%)G+细菌G-细菌肽聚糖含量很高(30-95)含量很低(5-20)磷壁酸含量较高(<50)0类脂质一般无(<2)含量较高(约20)蛋白质0含量较高染色结果紫色红色表一革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌对比三、实验仪器、材料和用具1、实验仪器和用具显微镜、擦镜纸、镜油、擦镜液、载玻片、盖玻片、接种环、酒精灯、吸水纸、镊子、打火机、相机(自带，CanonPowerShotA580)2、实验药品结晶紫、革氏碘染液、95%乙醇脱色液、番红染液3、实验样品枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和未知菌的18小时的液体培养液酵母菌平板、大肠杆菌平板、牙垢四、实验步骤本次实验可分为简单染色和革兰氏染色，通过简单染色学习基本的无菌操作技术，并练习细菌涂片标本的制备方法，包括操作规范、涂片、固定等。革兰氏染色主要学习染色的基本操作步骤，并以此鉴定菌种呈现革兰氏阳性或阴性结果。1、简单染色①载玻片处理：用镊子取在75%酒精中浸泡的载玻片，用吸水纸吸取酒精，在火焰上烘烤准备涂菌部位，除去油脂，冷却待用。②涂片：对于液体涂片，左手持菌液试管，右手持接种环在火焰上烧灼灭菌，带接种环冷却后在火焰旁从试管中取一环菌液，在载玻片上涂一直径约0.5-1cm的均匀薄膜。若从平板上取菌，灭菌后用无菌接种环挑取少量菌体，涂在预先滴有一小滴水的载玻片上，使其薄而均匀。最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。也可利用记号笔标记涂菌部位。③干燥：涂布后待其自然干燥。④固定：将涂片在酒精灯火焰上通过3-4次，以手背触载片不烫为宜（不超过60℃）。⑤染色：在固定好的涂片上滴加一滴草酸铵甲紫染液，染色1min。⑥水洗：用冲洗瓶或滴管缓慢冲洗染液到废液缸中，吸干。⑦镜检。2、革兰氏染色①制片：取大肠杆菌(菌液或平板)、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌(平板)、未知菌、牙垢制成涂片，重复普通染色中的步骤，干燥，固定。②初染：滴加1滴草酸铵甲紫染液，染色1min，水洗，吸干。③媒染：再滴加1滴碘液覆盖涂片1min，水洗。④脱色：用吸水纸吸去玻片上的残留水，用滴管滴加95%的乙醇脱色，轻轻摇动玻片直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，脱色约20-30s，不可过长。⑤复染：滴加番红染液复染3min，水洗。⑥镜检：用吸水纸吸干载玻片背面及标本周围的水渍，注意不要擦标本，可在玻片上第一滴水，盖上盖玻片，从低倍镜到油镜依次观察。注意细菌形态、大小、排列、颜色。⑦鉴定结果：革兰氏阳性菌(G+)呈紫色，革兰氏阴性菌(G-)呈红色。五、实验结果与分析本次实验中观察的样本共有6种，分别是大肠杆菌(平板)、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌(平板)、未知菌、牙垢的涂片。在对无菌操作熟悉之后，又经过几次尝试，完成了六组涂片的制作，由同组两个同学共同完成，所有涂片均在1000×条件下使用油镜观察，经照相机记录，显微结果与鉴定结果如下：1、大肠杆菌(平板)涂片菌种名称：大肠杆菌制片人员：孙禹放大倍数：10×100形态结构：杆菌、均匀聚集染色结果：红色鉴定结果：革兰氏阴性G-实验备注：实验中曾用大肠杆菌培养液进行革兰氏染色实验，但经过2次尝试效果都很不好。后采用平板取菌制作图片，效果较好。注意脱色时间不可过长，用番红染色时间要充分，才能使结果更好。2、枯草芽孢杆菌菌种名称：枯草芽孢杆菌制片人员：张宇成放大倍数：10×100形态结构：杆菌、均匀聚集染色结果：紫色鉴定结果：革兰氏阳性G+实验备注：枯草芽孢杆菌涂片的制作相对顺利，在显微镜下可见紫色杆状细菌，图片效果颜色略失真。3、酵母菌菌种名称：酵母菌制片人员：孙禹放大倍数：10×100形态结构：近圆形、少量聚集染色结果：紫色鉴定结果：革兰氏阳性G+实验备注：酵母菌虽为真核