绿脓杆菌检验技术.ppt

化妆品中铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）的检测目的：1.了解化妆品中铜绿假单胞菌检测的基本过程。2.掌握几种培养基的配置方法。3.掌握铜绿假单胞菌的鉴定及生化特征。原理：铜绿假单胞菌为需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌，有鞭毛，在普通培养基上生长良好，菌落大小不一，平均直径2mm～3mm，扁平，边缘不整齐，且常呈相互融合状态。氧化酶阳性，能产生绿脓菌素，此外还能液化明胶，还原硝酸盐产生氮气，在42℃条件下可以生长，可与类似菌区别。操作步骤操作步骤实验一培养基的制备及细菌的分离培养实验目的实验原理操作步骤操作步骤注意事项细菌的分离培养方法：平板划线法有几种，可根据不同情况选用其中一种。(1)平行划线法此法适用于含菌不多的液体标本，如脑脊液(CSF)、腹水、分泌物、脓汁以及稀薄的菌液等。①左手斜持平板底，右手持接种环。接种环在火焰上灭菌，冷却后，沾取一接种环标本，先在平板的一端涂开，并从此处开始向下划密集的平行线，约占平板面积的一半。②将平板转180°角，从平板另一端开始也划密集的平行线，直到划满平板的剩余部分。将平板底放入盖内，接种环火焰灭菌后放下，将平板倒置，37℃培养。(2)分区划线法。此法适用于含菌多的检测标本，如粪便，喀痰、细菌固体培养物等。①划线前的操作同平行划线法。先在平板的一端将标本涂开并在平板的1/5～1/4面积上划密集的平行线，接种环火焰灭菌。②将平板转约70°角，待接种环冷却后，使接种环通过已划线的1区5～7次，以后即不与1区接触作连续密集划线，约占平板面积的1/4，接种环再通过火焰灭菌。③再转平板约70°，如上法在第3区划线，此后接种环不再灭菌。④重复上述操作在第4区划线，划满余下的培养基表面。将平板底放入盖内，接种环灭菌后放下，置37℃培养。实验二染色镜检及五项指标试验革兰氏染色方法4．染色：①初染:将结晶紫染液加于涂膜上，1min。②媒染:水洗后加芦戈氏碘液处理，1min。③脱色：水洗后用95％乙醇脱色，并摇动玻片，直至流下的液体无色为止，约需0.5min。④复染：水洗后加石炭酸复红稀释液染色，1min。⑤水洗，用滤纸吸干，待标本充分干燥后进行镜检。5．镜检：干燥后，用油镜观察。判断两种菌体染色反应性。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌（G+），被染成红色的为革兰氏阴性菌（G-）。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。。注意事项：革兰氏染色方法操作步骤铜绿假单胞菌镜下形态图示：氧化酶试验实验三结果观察及报告绿脓菌素实验：2~3个可疑菌落→绿脓菌素培养基→37℃24h→3~5mL氯仿→振荡提取液呈蓝色→取液体于一新试管+1mL1mol/L盐酸上层盐酸内变为红色为阳性，不变色则为阴性。硝酸盐还原产气实验：可疑菌落→硝酸盐蛋白胨水→37℃24h→小倒管内有气体产生为阳性，否则阴性。明胶液化实验：可疑菌落→穿刺接种于明胶培养基→37℃24h→取出放冰箱10~30min呈溶解状为阳性，不溶解则为阴性。42℃生长实验：可疑菌落→普通琼脂斜面→42℃24h→铜绿假单胞菌生长，而近似的荧光假单胞菌不能生长。结果判断革兰氏染色（Gramstaining）:革兰氏染色法是由丹麦医生Gram于1884年创立，其简要操作分初染→媒染→脱色→复染。如果染色得当，镜检发现G+菌体呈蓝紫色，G-菌体呈浅红色。通过革兰氏染色法可把所有细菌分两在类。因此它是分类鉴定菌种的重要指标。其染色机制：通过初染和媒染操作后，在细菌细胞的膜或原生质体上染上了不溶于水的结晶紫与碘的大分子复合物。革兰氏染色阳性（GramPositive）:革兰氏阳性菌由于细胞壁厚、肽聚糖含量较高和其分子交联度较紧密，故在用乙醇洗脱时，肽聚糖网孔会因脱水而明显收缩，再加上它基本不含类脂，故用乙醇处理不能在壁上溶出缝隙，因此结晶紫与碘复合物仍牢牢阻留下其细胞壁内，使其呈现蓝紫色。革兰氏染色阴性（GramNegative）:革兰氏阴性细菌因其壁薄、肽聚糖含量低和交联松散，故遇乙醇后，肽聚糖网孔不易收缩，加上它的类脂含量高，所以当乙醇把类脂溶解后，在细胞壁上就会出现较大的缝隙，这样，结晶紫与碘的复合物就极易被溶出细胞壁，因此通过乙醇脱色后，细胞又呈无色。这时，再经番红等红色染料进行复染，就使革兰氏阴性获得了浅红色。