DNA测序技术及其应用.ppt

11引言造福人类的HGP2.第一代测序技术化学降解法技术路线化学降解法刚问世时，准确性较好，也容易为普通研究人员所掌握，因此用得较多。而且化学降解较之链终止法具有一个明显的优点，即所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成产生的拷贝，排除了合成时造成的错误。但化学降解法操作过程较麻烦，且用到放射性物质，逐渐被简便快速的Sanger法所代替。双脱氧链终止法双脱氧链末端终止法测序原理示意图PSanger法因操作简便，得到广泛的应用。后来在此基础上发展出多种DNA测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。荧光自动测序技术3730全自动测序仪杂交测序技术杂交测序检测速度快，采用标准化的高密度寡核苷酸芯片能够大幅度降低检测的成本，具有部分第二代测序技术的特点。但该方法误差较大，且不能重复测定。通过几十年的逐步改进,第1代测序仪的读长可以超过1000bp,原始数据的准确率可以高达99.999%,测定每千碱基序列的成本是0.5美元,每天的数据通量可以达到600000碱基。第一代测序技术在分子生物学研究中发挥过重要的作用,如人类基因组计划(humangenomeproject,HGP)主要基于第一代DNA测序技术。目前基于荧光标记和Sanger的双脱氧链终止法原理的荧光自动测序仪仍被广泛地应用。2.第二代测序技术过程概述2.1454测序技术原理图：测序数据输出：指示器454测序法的突出优势是较长的读长，目前GSFLX测序系统的序列读长已超过400bp。虽然454平台的测序成本比其他新一代测序平台要高很多，但对于那些需要长读长的应用，如从头测序，它仍是最理想的选择。缺点是无法准确测量同聚物的长度。2.2SOLEXA测序技术原理图测序过程：测序过程：2.3SOLID技术测序过程：超高通量是SOLID系统最突出的特点，目前SOLID3单次运行可产生50GB的序列数据，相当于17倍人类基因组覆盖度。表1三种二代测序技术对比4.第三代DNA测序技术三代测序技术是以单分子测序为特点的测序技术单分子即时DNA测序技术(SMRT)HeliScope单分子测序基于荧光共振能量转移的即时DNA测序纳米孔单分子测序技术第三代测序技术1、目前一期的读取速度为3bp/s2、它实现了DNA聚合酶内在自身的processivity（延续性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很长的片段），一个反应就可以测非常长的序列。3、它的精度非常高，达到99.9999%。标记荧光基因零级波导的纳米结构4.3基于荧光共振能量转移的即时DNA测序DNA分子以一次一个碱基的速度依次通过纳米小孔,利用核酸外切酶的特性来识别出不同的DNA碱基优点：纳米孔测序的优势在于它不需要对DNA进行标记，也就省去了昂贵的荧光试剂和CCD照相机。优点：表2各种测序技术比较5.基因测序的应用全基因组重测序全基因组重测序全基因组重测序全基因组重测序转录组测序（TRANSCRIPTOMESEQUENCING）转录组测序（TRANSCRIPTOMESEQUENCING）新型病源体的快速鉴定艾滋病毒抗药性HIVSEQUENCING外显子&目标区域测序目标外显子组测序VS全基因组测序目标外显子测序应用基因测序的展望光影成像DNA测序技术