PCR技术PPT课件0.ppt

聚合酶链式反应（PCR）一、PCR的定义：PCR（polymerasechainreaction)：聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。DNA扩增的传统方法：一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛选，牵扯到DNA酶切、连接、转化、培养及探针杂交等技术，虽然技术上已无难点，但操作复杂，需数周到数月的时间，且不利于普及。PCR技术：1985年由美国Cetus公司的KaryMullis首创，可以将微量目的DNA片段扩增一百万倍以上。优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等，广泛应用于微生物学、考古学、法医学及体育等领域，并已普及到许多普通实验室，大大简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易地对目的基因进行分析、鉴定。KaryMullis本人因此获1993年诺贝尔化学奖。二、PCR的原理：用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段，类似于天然DNA的复制过程。以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合，基本反应步骤分三步：1.变性(Denaturation)：加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链。94℃30″2.退火(复性)(Annealling):突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。55℃30″3.延伸(Extension):将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合酶、4种dNTPs及镁离子等存在的条件下，以引物的3′端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新DNA链。72℃1′上述3步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增106～109倍。PCR的基本反应步骤双链DNA分子双链断开模板与引物结合循环1循环1循环1双链断开模板与引物结合循环294℃变性双链断开循环3循环3循环nPCR扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物所决定的。反应初期，原来的DNA担负起使模板的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的片段急剧增多而成为主要模板，最终的扩增产物是介于两种引物5’端之间的DNA片段。三、PCR的成分和作用：终浓度1.缓冲液：10～50mMTris-Cl(pH8.4)维持Taq酶作用环境的偏碱性25～50mMKCl促进引物退火，>50mM会抑制Taq酶的活性。100μg/ml牛血清白蛋白(BSA)对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作用，建议使用乙酰化的BSA。明胶、Tween-20、二硫苏糖醇(DTT)也有类似作用。2.MgCl2:1.5～2.0mMTaq酶具有Mg2+依赖性，显著影响反应的特异性和扩增片段的产量，过量能增加非特异扩增并影响产率，过低则酶活性显著下降。3.dNTPs:dATP、dGTP、dCTP、dTTP——底物0.02～0.2mMdNTPs可与Mg2+结合，应注意Mg2+浓度与dNTPs浓度之间的关系，Mg2+浓度比dNTPs浓度高0.2～2.5mM。过高：加快反应速度，还可增加碱基的错误掺入率和室验成本。过低：反应速度下降，可提高实验的精确性。4.引物(Primer-P)：预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。0.2～1μM偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间形成引物二聚体，产量降低。偏低：产量降低。5.TaqDNA聚合酶：耐高热0.5～5U/100μl1U/25～50μl偏高：引物非特异产物的扩增偏低：产物量降低6.模板DNA(Template):最低102～105bpDNA片段，实际用量远远超过此量，用量需在实验中摸索。1～5μl过高：非特异产物增加过低：产量降低7.水：去离子水，补足整个反应体积。四、PCR反应体系：常用30μl各种成分的实际用量应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓度进行核算。10×buffer：1×30/10=3μlMgCl2:1.5×30/25=1.8μldNTPs:0.2×30/10=0.6μl引物P：0.4×30×2/10=2.4μlTaq酶(5U/μl)：1/5=0.2μl模板：1μl水：30-3-1.8-0.6-2.4-0.2-1=21μl操作：5份标本总体积30μl×6=180μl1.取一0.5mlEp管，依次加入下列试剂：10×buffer：3μl×6=18μlMgCl2:1.8μl×6=10.8μldNTPs:0.6μl×