常用液相色谱柱原理及使用与维护保养.ppt

常用液相色谱柱使用与保养SOP主要内容1、液相色谱柱基本理论知识2、常用液相色谱柱使用方法与维护保养3、液相色谱柱常见问题分析与解决方案1.2液相色谱柱的结构及其主要功能液相色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝（封头）与柱填料等组成。柱管：多用不锈钢制成，若果使用时柱压不高于70kg/cm2时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。用于柱填料的装填。压帽：即色谱柱两端套合于柱管端外壁的塑性圆柱帽，中部有小孔，多为聚四氟乙烯制成，用于固定筛板。密封环：位于接头螺旋环内壁的弹性环，多为聚四氟乙烯制成，用于色谱柱两端压帽与柱外壁的密封。1.3液相色谱柱的分类与应用范围分类方法很多，可按键合相类型、用途（分析型与制备型）、基质种类等进行分类。1.3.1硅胶基质柱（4大类）目前，分析型液相色谱柱多为硅胶基质柱，细分为：高纯硅胶柱：以高纯度硅烷化硅胶（Silica）为填料，应用范围较广，但只能在PH2.0-7.5，小于60度的条件下使用。又由于强极性硅羟基（Si-OH)的次级保留效应较强，所以应用受到局限，已被键合相柱所取代。反相硅胶柱：是以硅烷化硅胶为基质，表面键合弱极性官能团的固定相。目前多用C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）、C6H5（phenyl，苯基）等。用于分离大多数有机化合物，应用范围最广。正相硅胶柱：是以硅烷化硅胶为基质，表面键合极性官能团的固定相。目前较多的为：NH2—（氨基）、CN—（氰基）、DIOL（二羟基，也常做HILIC单独分类列出，多用于分离有机酸、蛋白质等）。多用于分离光学异构体和反相柱子不能分离的极性比较大的物质。离子交换柱：是以硅烷化硅胶为基质，以磺化交联键合强阳/阴离子基团（磺酸盐/季铵碱）的固定相，又分为强酸性、强碱性、弱酸性、弱碱性等不同规格。用于分离解离性较强的有机盐类化合物。（注意：不要同离子色谱混淆，离子色谱主要是分离无机盐类化合物或某些带点离子。）1.3.2聚合物基质柱聚合物基质柱是指采用聚苯乙烯—二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸脂、多孔性微球蛋白等聚合物凝胶作为主要填料的一类色谱柱。其相对于硅胶柱具有更强的疏水性及更宽泛的pH范围（1.0～14.0），但柱效较低，目前主要应用于凝胶渗透色谱（GPC）、凝胶过滤色谱（GFC）及分子排阻色谱（MEC）。主要用于分离蛋白质类等大分子化合物。1.3.3其他无机物填料柱这类色谱柱仅限于特殊用途，主要有石墨化碳、氧化铝（Al2O3）、氧化锆（ZrO2）等填料。不需要进行表面改性，其自身表面即可对各类化合物有强保留。可在任意pH（氧化铝除外，不能大于12.0）及高温度（可达100℃）下使用。其中，1.3.5常用液相色谱柱主要应用范围与特点汇总1.3.5.1反相色谱柱1.3.5.2正相色谱柱1.3.5.3聚合物基质柱（eg.聚苯乙烯柱）单独的聚苯乙烯类填料柱主要用于分离蛋白质类等大分子化合物，多用于GPC、GFC、MEC等；若与离子交换基团共键则形成离子交换柱，用于分离酸性化合物（磺酸基团）、碱性合物（季铵基团）及药物代谢产物等。特点：在1＜PH＜13的流动相中稳定；分离峰形较好，柱子寿命较长。1.3.5.4其他无机物填料柱如氧化铝、石墨化碳、氧化锆、硅藻土等，主要作制备色谱用。1.4液相色谱柱制备工艺简述不同品牌色谱柱制备工艺各异，但都可归纳为如下流程（以硅胶柱为例）：硅烷化硅胶制备（四乙氧基硅烷脱乙基与聚合）→Si-OH基暴露（脱乙基，置换成H）→海绵状多孔硅胶构造（物理匀质过程）→官能团键合（各种官能团与Si-OH键合）→端基封口（对残余的Si-OH用小分子的氯-甲基、氯-乙基键合）→润湿混合（加乙醇等调匀，其配方各厂家均有专利保护）→装填（机械装填或手工装填，层层装填，压紧，润湿）→高压平衡（轴向加压或径向加压，各厂家均有专利保护）→干燥（此步为关键工艺步骤，各厂家均有专利保护）→削平→组件安装→预平衡→柱效测试流动相平衡→柱效测试→封口→包装1.5液相色谱柱分离机理概述2、常用液相色谱柱使用方法与维护保养(1)认识色谱柱规范化使用与保养的必要性：延长色谱柱使用寿命，降低色谱柱使用成本，逐步提高分析人员色谱柱使用与维护水平，确保试验数据的准确性、可靠性和重现性，提升个人在色谱领域的竞争力。(2)熟悉几个概念：液相色谱柱：指用于液相色谱分离的柱形固定相，由柱管、压帽/卡套、筛板（滤片）、填料、接头等组合而成，可用于液相色谱分析与制备。色谱柱再生：指色谱柱在非正常情况下，针对异常现象及原因采取的一系列修复补救措施，以提高色谱柱柱效和延长其使用寿命的处理过程。运载溶剂（ShippingSolvent）：指色谱柱生产厂商在柱出厂测试合格后饱和于色谱柱内的合适溶剂，以利于运输保存，多与保存溶剂相同。保存条件（Stora