DNA测序技术的发展历程及其研究进展.ppt

一、DNA序列测定的意义DNA的序列测定是分子生物学研究中的一项非常重要的和关键的内容。如在基因的分离、定位、基因结构与功能的研究、基因工程中载体的组建、基因表达与调控、基因片段的合成和探针的制备、基因与疾病的关系等等，都要求对DNA一级结构的详细了解。人类基因组计划（HumanGenomeProject－HGP）于1990年正式启动，其主要目标有：识别人类DNA中所有基因（超过10万个）；测定组成人类DNA的30亿碱基对的序列；将这些信息储存到数据库中；开发出有关数据分析工具；致力于解决该计划可能引发的伦理、法律和社会问题。已于2003年完成。人类基因组计划是当代生命科学一项伟大的科学工程，它奠定了21世纪生命科学发展和现代医药生物技术产业化的基础，具有科学上的巨大意义和商业上的巨大价值。1949年,FrederickSanger开发了测定胰岛素两条肽链氨基末端序列的技术,1953年测定了胰岛素的氨基酸序列。1950年，Edman提出了蛋白质的N端测序技术,后来在此基础上发展出了蛋白质自动测序技术。1965年，Sanger等发明了RNA的小片段序列测定法,并完成了大肠杆菌5SrRNA的120个核苷酸的测定。同一时期,Holley完成了酵母丙氨酸转运tRNA的序列测定。1975年，Sanger和Coulson发明了“加减法”测定DNA序列。1977年，Sanger在引入双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)后,形成了双脱氧链终止法,使得DNA序列测定的效率和准确性大大提高。1977年，Maxam和Gilbert报道了化学降解法测定DNA的序列。DNA序列测定技术出现后,迅速超越了蛋白质和RNA测序技术,成为现代分子生物学中最重要的技术。三、DNA测序技术的发展1、第一代DNA测序技术1.1化学降解法碱基化学降解法刚问世时，准确性较好，也容易为普通研究人员所掌握，因此用得较多。而且化学降解较之链终止法具有一个明显的优点，即所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成产生的拷贝，排除了合成时造成的错误。但化学降解法操作过程较麻烦，且用到放射性物质，逐渐被简便快速的Sanger法所代替。1.2双脱氧链终止法P双脱氧链末端终止法测序原理示意图Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。后来在此基础上发展出多种DNA测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。1.3荧光自动测序技术目前所用自动测序技术的改进3730全自动测序仪1.4杂交测序技术通过几十年的逐步改进,第1代测序仪的读长可以超过1000bp,原始数据的准确率可以高达99.999%,测定每千碱基序列的成本是0.5美元,每天的数据通量可以达到600000碱基。第一代测序技术在分子生物学研究中发挥过重要的作用,如人类基因组计划(humangenomeproject,HGP)主要基于第一代DNA测序技术。目前基于荧光标记和Sanger的双脱氧链终止法原理的荧光自动测序仪仍被广泛地应用。2、第二代DNA测序技术第二代测序技术将片段化的基因组DNA两侧连上接头,随后用不同的方法产生几百万个空间固定的PCR克隆阵列。每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。然后进行引物杂交和酶延伸反应。由于所有的克隆都在同一平面上,这些反应就能够大规模平行进行,每个延伸反应所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行,从而获得测序数据。DNA序列延伸和成像检测不断重复,最后经过计算机分析就可以获得完整的DNA序列信息。第二代测序技术包括：454测序技术、Solexa测序技术和SOLiD测序技术。2.1454测序技术454生命科学公司在2005年最早推出了第二代测序平台GenomeSequencer20，并测序了支原体Mycoplasmagenitalium的基因组。并在2007年推出性能更优的第二代基因组测序系统一GenomeSequencerFLXSystem(GSFLX)。罗氏在2005年便与454公司洽谈并购事宜，2007年完成并购，紧接着公布了DNA双螺旋的发现者之一——沃森(JimWatson)的个人基因组，测序总花费不到一百万美元。2.2Solexa测序技术GenomeAnalyzer系统需要的样品量低至100ng，文库构建过程简单，减少了样品分离和制备的时间，配对末端读长可达到2×50bp，每次运行后可获得超过20GB的高质量过滤数据，且运行成本较低，是性价比较高的新一代测序技术。SOLID通过连接反应进行测序。其基本原理是以四色荧光标记的寡核苷酸进行多次连接合成，取代传统的聚合酶连接反应。具体步骤包括：3、第三代DNA测序技术第三代测序技术非常惊人！1、它实现了DNA聚合酶内在自身的反应速度，一秒可以测10个碱基，测序速度是化学法测序的2万倍。2、它实现了DNA聚合酶内在自身的processivity（延续性，也就