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——MSPvs.BSPDNA甲基化基本概念DNA甲基化是唯一发生在哺乳动物细胞内DNA合成后的修饰作用,是调节基因表达的机理之一。DNA甲基化能关闭某些基因的活性,去甲基化则诱导基因的重新活化和表达。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达。结构基因中广泛存在着相邻的两个CG,其中胞嘧啶的5位碳原子通常被甲基化且两个甲基基团在DNA双链大沟中呈特定三维结构(CpG)。CpG序列在哺乳动物基因组中出现的频率仅有1%,远低于基因组中的其它双核苷酸序列。但在基因组的某些区域中,CpG序列密度很高,可以达均值的5倍以上,成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区,形成所谓的CpG岛。CpG岛(CpGIsland)DNA甲基化生物学作用2.DNA甲基化与肿瘤继人类基因组计划结束后,2003年人类表观基因组协会(HumanEpigenomeConsortium,HEC)宣布开始投资和实施人类表观基因组计划(HEP)。随着对甲基化研究的不断深入,各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。甲基化检测方法分为两类,甲基化分型(methylationtyping)甲基化图谱(methylationprofiling),后者又被称为甲基化组学(methylome)。这些方法概括起来可分为三类:基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找。根据研究所用处理方法不同,即DNA的甲基化修饰(指CpG二核昔酸中胞嘧啶的5位碳原子加上一个甲基基团,形成5甲基胞嘧啶)。一般而言,可以分辨出甲基化修饰的方法有以下几种:由于受到仪器等条件的制约,应用比较广泛的是前三种方法。DNA甲基化PCR特点结合重亚硫酸盐的测序法(BisulfiteGenomicSequence,BSP)DNA甲基化PCR影响因素1.引物因素2.反应体系因素3.反应温度因素亚硫酸氢钠的浓度最好控制在3.0-3.9mol/L。修饰时间控制在10-16h,修饰时间过长会导致甲基化胞嘧啶也会转化为尿嘧啶且DNA模板破坏加剧;时间过短会导致修饰不彻底。从而可能出现PCR只能扩出U,M出不来。反应温度应控制在50~55℃(若用国产恒温水浴箱建议温度设定在53℃为好);DNA模板量应控制在<=2ug为宜,以保证修饰完全。引物设计——获取启动子区域序列1)http://www.genome.ucsc.edu/引物设计——设计引物1)提取DNADNA甲基化检测与测序分析Thanks!