重组基因导入受体细胞2.pptx

二、依赖于重组子结构特征分析筛选(二)限制性内切核酸酶消化载体被外源片段插入后，其限制性酶切割产物会发生变化，可根据电泳结果来判断外源基因是否插入了载体及其插入方向。通过快速裂解菌落鉴定分子大小的方法难以区分期望重组子和非期望重组子，因为重组质粒DNA分子中，质粒载体可能会与一个以上的外源DNA片段连接重组。采用限制性核酸内切酶分析法不仅可以进一步筛选鉴定重组子，且能判断外源DNA片段的插入方向及分子质量大小等。基本做法是从转化菌落中随机挑选出少数菌落，快速提取质粒DNA，用限制性核酸内切酶酶解，并通过凝胶电泳分析来确定是否有外源基因插入及其插入方向等。完全酶切部分酶切三、核酸分子杂交分析分子杂交理想的探针标记物应满足的条件：1)标记物不会影响探针的主要理化性质，如杂交特异性、杂交稳定性及酶反应待征等；2)检测灵敏度高、特异性强、本底低、重复性好；3)操作简便、省时．经济实用：4)化学稳定性高、易于长期保存；5)安全、无环境污染。常用于分子杂交的探针标记物可分为放射性及非放射性两大类。1.放射性标记物2.非放射性标记物3.探针标记方法体外标记(1)切口平移标记法(2)随机引物标记法随机引物：46使用随机引物标记的探针一般长400-600个核苷酸，具多种序列，但都与模板互补。与切口平移法不同的是，该方法标记的是模板互补链，而非模板本身。(二)核酸探针杂交分析核酸分子杂交技术：具一定同源性的两条(DNA或RNA)单链在适宜的温度及离子强度等条件下,可按碱基互补配对原则特异性地复性，形成双链。Blot:是将待测生物大分子结合到一定的固相支持物上的方法。(这些结合在固相支持物上的生物分子即可与存在于液相中的探针分子进行杂交。)固相支持物与有效的转移方法是此技术的成败关键。基本做法是将待测核酸变性后，用一定的方法将其固定在硝酸纤维膜(或尼龙膜)上，这个过程也称为核酸印迹转移，然后用经标记示踪的特异核酸探针与之杂交结合，洗去其他的非特异结合核酸分子后，示踪标记将指示待测核酸中能与探针互补的特异DNA片段所在的位置。根据待测核酸的来源以及将其分子结合到固相支持物上的方法的不同，核酸分子杂交检测法可分为菌落印迹原位杂交、斑点印迹杂交、Southern印迹杂交和Nothern印迹杂交四类。核酸分子杂交是核酸分析的重要方法，是鉴定重组DNA的最通用方法杂交方法适用范围菌落印迹杂交检测细菌体固定在膜上后，经裂解释放的DNA斑点杂交检测未经凝胶电泳分离的，固定在膜上的DNA或RNA原位杂交直接检测细胞或组织中的DNA或RNASouthern印迹杂交检测经酶切、凝胶电泳分离的，已转移到膜上的DNANorthern印迹杂交检测经凝胶电泳分离的，已转移到膜上的RNA(1)Southern印迹杂交它是根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过与已标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用以检测这些被转移的DNA片段。其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。（a）Southern杂交SouthernDNA印迹杂交之X光显像图片水稻（OryzasativaL.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加样在含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带，表明含有水稻的psbA基因序列在印迹技术中，硝酸纤维素滤膜是目前应用最广的一种固相支持物，但它也存在一些不足之处：第一、硝酸纤维素滤膜是依赖疏水性相互作用结合DNA的，这种结合并不十分牢固。第二、硝酸纤维素滤膜质地校脆弱，容易碎裂，因此操作须小心谨慎(待别是经烘烤后)。第三、硝酸纤维素滤膜与核酸的结合有赖于高盐浓度，在低盐浓度时结合DNA效果不佳，不适宜于电转印迹法。第四、硝酸纤维素滤膜对于小分子质量的DNA片段(特别是小于200bp的DNA片段)结合能力不强。尼龙膜(2)Northern印迹杂交在RNA变性凝胶电泳中常用的变性剂有甲醛、乙二醛、羟甲基汞、尿素和甲酰胺等。(3)斑点印迹杂交和狭线印迹杂交两种方法的基本原理和操作步骤相同，即通过特殊的加样装置将变性的DNA或RNA核酸样品，直接转移到适当的杂交滤膜上，然后与核酸探针分子进行杂交以检测核酸样品中是否存在特异性DNA或RNA。两者的区别仅在于呈现在杂交滤膜上的核酸样品分别为圆斑状和狭线状。斑点杂