几种常用生物活性测试方法简介.ppt

几种常用生物活性测试方法简介等温滴定量热法(IsothermalTitrationCalorimetry,ITC)是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。受体-配体复合物的形成伴随着能量的释放或吸收，导致样品池温度的变化，参比池始终保持在实验温度，反馈系统提供热或降低热量来补偿样品池的温度变化，每注射一次后系统恢复至平衡状态再进行下一滴滴定。结果以峰的形式表示平衡温度偏移所需要的能量，峰的面积相当于反应释放或吸收的热量。IsothermalTitrationCalorimetry(ITC)ITC独特之处：样品用量小，方法灵敏度和精确度高。最小可检测热效应0.125uJ，生物样品最小用量0.4ug，滴定池体积1.43ml实验时间较短。典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间。操作简单。整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由软件分析ITC得到的数据。量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。surfaceplasmonresonance,SPRsurfaceplasmonresonance,SPRsurfaceplasmonresonance,SPRsurfaceplasmonresonance,SPR分子水平活性测试方法Time-resolvedfluorescenceenergytransfer(TR-FRET)镧系元素（铕Eu和铽Tb）半衰期长(us-ms)，将Eu纳入立体笼中，形成稳固复合体，笼收集光将能量转移到Eu上。Time-resolvedfluorescenceenergytransfer(TR-FRET)GeneralFormatForFRET1.根据需要，使用1XBRDTR-FRETAssayBuffer分别将成分Eu-labeleddonor和dye-labeledacceptor(带straptavidin标记）100倍稀释；2.向384孔板中，每孔加入稀释好的Eu-labeleddonor和dye-labeledacceptor各2.5ul；3.向每孔中加入一定量的化合物，阳性对照组加入对应体积的DMSO；振荡反应1min；4.根据需要，使用1XBRDTR-FRETAssayBuffer将组分BETBromodomain40倍稀释。分别向化合物检测组和阳性对照组加入稀释好的BETBromodomain2.5ul每孔；5.根据需要，使用1XBRDTR-FRETAssayBuffer将组分acetylatedLigand1（带Biotin标记）40倍稀释。向阴性对照组加入稀释好的BETBromodomain2.5ul每孔；6.每孔加入一定量的BRD4bromodomain，保证每个反应体系中含有4.5ng含量的酶。7.室温静置反应1h后，测值340/665nm。enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)双抗夹心法（SandwichELISA）enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)1.Integrinα6β1蛋白5µg/ml，50µl/孔，4ºC固定过夜；（包被Coating）2.PBS250µl/孔冲洗3次；（封闭Blocking）3.加入上述多肽，其中CRWY-biotin工作浓度为0.00005mol/L，体积为50µl。阻断肽为0.0005mol/L，50µl；4.室温结合1小时；5.HEPES冲洗6次，250µl/次；6.加入HRP-straptavidin1：3000，室温1小时；7.HEPES冲洗6次，250µl/次；8.加入50µlTMB，观察显色效果；9.加入100µl0.5MH2SO4终止反应，450nm测OD值。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。DMSO能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在540或720nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。用于检测细胞增殖、细胞毒性。MTTMTT的缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响。MTT有致癌性。MTT对菌很敏感，配成的MTT需要无菌保存。可靠度和灵敏度易受细胞容积、氧化还原剂、有色物质等因素干扰。CellCountingKit