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基因工程复习总结【实用文档】doc文档可直接使用可编辑，欢迎下载思考题第二章分子克隆工具酶1简述基因工程研究用的工具酶的类型和作用特点。２。说明限制性内切核酸酶命名原则(举例)。3.限制内切核酸酶的星活性是指什么？在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性.星星活性是限制性内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。引起星星活性的因素：甘油浓度高(>５％），酶过量（〉100U/ml）,离子强度低（〈2５mmｏl/Ｌ），pH值过高(〉8.０）,或是加了有机溶剂如ＤMSO（二甲基亚砜)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺,或是用其它2价阳离子如Mn2+、Cu2+、Ｃo2＋或Ｚｎ2+代替了Mg２+。4．T4DNAｌｉgaｓｅ和E。colilｉgaｓe有什么异同?5.连接酶的反应温度如何选择，为什么？连接酶最适的反应温度应是３7℃,但在这一温度下粘性末端的氢键结合不稳定，因此连接反应常采用的最佳温度一般在4—１6℃间，通常多选用12－１6℃30分钟到1６小时。6。什么是Ｋlenｏw酶？有什么作用？KｌenowDＮＡ聚合酶是从全酶中除去5′―３′外切活性的肽段后的大片段肽段,而聚合活性和３′―５′外切活性不受影响.也称为Klenow片段(Ｋｌenowfrgmeｎt），或E．coliＤNA聚合酶Ⅰ大片段（E.coｌiDNApoｌymｅraseⅠｌaｒｇefragｍent).它也可以通过基因工程得到,分子量为76kＤa.由于没有5′―3′外切活性，使用范围进一步扩大。①补平3′凹端,如果使用带标记的dNＴＰ，则可对DNA进行末端标记。②抹平DＮA３′凸端在3′―5′外切活性③通过置换反应对DNＡ进行末端标记④在cＤＮA克隆中合成第二链⑤随机引物标记⑥在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA···7。如何利用工具酶来研究某一个基因内含子的存在？···8.哪些工具酶可以用于探针标记？T４ＤNA聚合酶的替代合成法标记DNA探针。反转录酶还可利用单链DNＡ或RNＡ作模板合成分子探针.第三章分子克隆载体１.基因工程载体应具备哪些特点？能在宿主细胞中独立复制;有一定的选择标记,易于识别和筛选；有合适的限制酶位点,可插入一段较大的外源DNA,而不影响其本身的复制；最好有较高的拷贝数，便于载体制备。2.作为一个最基本的载体，它必须具备哪些功能元件？能独立复制的单链或双链ＤＮA;选择标记基因；合适的限制酶位点。···3.请简要描述λ噬菌体溶原状态和裂解循环的基因调控模式及其在构建载体中的作用。4.丝状噬菌体载体克隆中经常遇到哪些问题?丝状噬菌体载体的优点ａ．可产生单链DNA或双链DNA，分别用于不同的目的单链:为丝状噬菌体，可分泌到细胞外，用于测序或制备探针双链：为含双链RFDNＡ存在于细菌菌落中，可供基因操作，如酶切,重组、提取、转化均应为双链DNＡ。具有质粒的优点ｂ．丝状噬菌体所能包装的DNA长度没有一定的限制,有些噬菌体颗粒可包装比野生型丝状噬菌体DNA长7倍的DNA。缺点a。较大的外源DＮA片段被克隆以后,在噬菌体扩增过程中往往不稳定，很容易发生缺失的现象，这可能是由于感染较短的噬菌体比长的噬菌体更具竞争优势所致。b．单链载体分子感染的细胞中往往单双链混杂，纯化某种类型的分子（尤其是双链分子）比较费力,同时由于重组DNA容易产生缺失,培养时间不能长，故所得ＤNＡ的量有限。c.重组中，经常出现一些能以两种可能方向插入的载体却仅以一种特定方向插入外源DNＡ片段的情况，这是因为外源DＮA反向链的序列，在不同程度上干扰了载体基因间区域的功能所致。克服“缺失"的办法ａ.侵染菌应避免在液体培养基中连续继代培养ｂ.应用贮存于-70℃,重组ｐhageＭ１３感染细菌后铺板，再从噬菌斑中央部分挑取细菌后进行小规模培养c。培养时间应尽可能短（通常4－8h)d。收获噬菌体的培养液不能再做为原液继续培养(因在重组子和野生型噬菌体共培养中，野生型具有选择优势,几代培养后可消除重组子)。第四章人工染色体载体1.大容量克隆载体有哪些种类,各有何特点？·····2。简述利用YAC克隆载体构建基因文库的原理。·····３。简述黏粒、YＡC、BAC克隆载体、P1噬菌体载体的基本构成元件.4.黏粒载体具有哪些优缺点?怎样克服其缺点?黏粒的优点（1)同时具有λ噬菌体和质粒载体的特性（2)具有高容量的克隆能力柯斯质粒的缺点a.两个粘粒之间，当存在同源序列时，可能会发生重组,结果使克隆的外源DNA片段重排或丢失。b。含不同重组DＮA的菌落生长速度不一。当柯斯质粒文库复制扩增时，由于不同的插入片段对宿主细胞作用的情况不同,结果会出现各种外源DＮA片段间的比例失调。另外不同重组柯斯质粒的产量相差悬殊。c。包装蛋白制备过程较复杂,