模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的PCR鉴定.ppt

十三模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的PCR鉴定一、实验目的：二、实验原理3.用PCR方法鉴定T-DNA插入纯合突变体农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。PCR方法为鉴定纯合突变体提供了有利手段。它利用三个引物LP、RP和BP，其中LP和RP是植物基因组上T-DNA插入位点两测的引物，BP是T-DNA区段上的引物。经过PCR，在野生型植株，LP和RP这对引物扩增出分子量较大的产物（野生型基因，大带）；在杂合突变体，LP和RP能扩增出分子量较大的产物（野生型基因，大带），另外BP和RP还能扩增出分子量较小的产物（小带）；在纯合突变体，只有BP和RP能扩增出分子量较小的产物（小带）。因此，利用以上三种引物做PCR，根据扩增结果能够容易地从群体中区分出纯合突变体。三、实验步骤(一)拟南芥基因组DNA提取1.原理DNA在化学上是稳定的，但它在物理上是易碎的，高分子质量的DNA长而弯曲，即具有极微弱的侧向稳定性，易受到最柔和的流体剪切力的伤害，由吸液、振荡、搅拌所致的水流能剪切断DNA双链。提取动物、植物、微生物基因组的DNA所面临的问题不尽相同，在这个实验中学习植物总DNA提取与鉴定。本实验采用CTAB法。CTAB的主要作用是破膜。CTAB属阳离子表面活性剂，能溶解膜蛋白与脂类，也可解聚核蛋白。在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，但是不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括E.coli的某些株）中制备纯化DNA。酚/氯仿/异戊醇的作用是去除核酸制品中的蛋白质，并有利于水相与有机相的分开，而且可以消除泡沫。异丙醇或乙醇的作用是脱去DNA周围水分子，使DNA失水而聚合沉淀。2、药品3.DNA提取步骤注意事项（二）PCR反应步骤（三)PCR结果的电泳检查步骤PCR产物电泳结果实例，纯合的野生型只有大带，纯合的插入突变型只有小带，杂合的插入突变型有大小2个带基因组DNA提取结果实例：左边泳道为分子量Marker畅想网络