生物制药医学宣教专家讲座.pptx

内容第五章抗体工程制药（1）抗体基本概念免疫反应免疫分子（抗体，补体，细胞因子等）免疫细胞：(淋巴细胞、粒细胞及白细胞、浆细胞、肥大细胞等)免疫器官：中枢免疫器官和周围免疫器官；A\中枢器官是免疫细胞发生和分化场所(胸腺--T、骨髓—成血干细胞和鸟类法氏囊---B)B\周围免疫器官是免疫细胞居住和发生场所:淋巴结、脾脏、黏膜相关淋巴组织----分布于呼吸道、消化道\泌尿系统黏膜Thymus免疫系统与免疫细胞生物制药医学宣教专家讲座B细胞T淋巴细胞Tc细胞攻击肿瘤细胞扫描电镜像(体外培养试验人工加色)人T淋巴细胞攻击母细胞瘤细胞T辅助细胞介导B细胞激活巨噬细胞吞噬作用中性粒细胞、血小板等3、免疫因子：主要包含膜表面免疫因子和体液免疫因子。B和T细胞表面有各自特异性膜表面抗原受体BCR和TCR,能识别特异性抗原并与之结合，开启特异性免疫。体液免疫因子主要包含抗体、补体和细胞因子。细胞因子是免疫细胞分泌低分子多肽，包含白细胞介素（IL）集落刺激因子（CSF）干扰素（INF）肿瘤坏死因子(TNF)及转化生长因子(TGF),含有多方面调整作用；现有细胞毒素和抗病毒功效，直接参加免疫应答效应过程（3）抗体特征抗体结合抗原活性抗体产生规律（4）抗体基本结构和多样性基因多样性决定抗体多样性(5）抗体分类抗体分类(5）抗体分类抗体体内生成理论第二节抗体工程研究抗体工程抗体工程二、免疫方法1.免疫剂量：应考虑抗原性强弱、分子量大小、动物状态和免疫时间。普通大:0.5－1mg/只，小:0.1－0.6mg/只。2.免疫路径：皮内或皮下免疫采取多点注射(8~10点)。皮内注射易引发细胞反应，对提升抗体效价有利，但皮内注射较困难(因佐剂加入后粘度大)；半抗原宜皮内多点注射。用明矾作佐剂时，普通用于肌肉注射(因皮下注射易引发肉芽肿和脓肿)；腹腔和静脉注射多用于颗粒性抗原和加强免疫。对宝贵抗原，可采用淋巴结内直接注射抗原。3.免疫时间：首次和二次免疫之间要间隔约20天，二次以后每次间隔7~10天。第一次免疫后，机体处于识别阶段，若很快第二次注入抗原，极易造成免疫耐受。第二次以后，若间隔时间过长，则刺激变弱，造成抗体效价不高。三、动物采血法：1.颈动脉采血法2.心脏采血法（惯用于小动物）3.静脉屡次采血法四抗血清纯化、判定和保留多克隆抗体缺点2单克隆抗体技术杂交瘤技术原理：动物细胞融合技术HAT培养基是在惯用细胞培养基内添加了3种特殊成份：次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸腺嘧啶(T)。1.脾细胞：在体外5~7天内死亡，所以在HAT培养基中最终死亡。2.骨髓瘤细胞：普通细胞合成DNA有两条路径：一条是主要路径，即由糖、氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，此路径可被氨基蝶呤(A)所阻止。另一条是替换路径：在次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶(T)存在下，由次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)同时催化合成DNA小鼠骨髓瘤细胞为HGPRT缺乏缺点型细胞，在HAT中，正常合成DNA路径被氨基蝶呤(A)阻断，又因HGPRT缺乏而不能用替换路径，最终只能死亡。3.杂交瘤细胞：合成DNA路径阻断，但可利用原脾细胞HGPRT完成替换路径作用，存活。HAT选择培养基选择杂交瘤细胞原理示意图单克隆抗体McAb特点1单克隆抗体含有导向治疗作用存在问题3基因工程抗体1、获取目标基因普通都是提取杂交瘤细胞系mRNA经反转录PCR（RT－PCR）获取抗体某一特定基因区段，如重链和轻链可变区（VH和VL）基因。2、与适当载体连接在一起依据将要表示细胞来选择适当表示载体，这些载体必须高效表示，对细胞本身无害，又带有选择标识。3、基因工程抗体表示导入表示细胞，筛选阳性克隆后，按其目标不一样，可选取原核细胞、真核细胞、转基因植物和动物等不一样表示方式进行表示。A、原核细胞表示融合表示－抗体末端附加一段其它肽段（如膜蛋白），作为标签，有利于反抗体文库进行淘筛，且有利于对克隆和抗体活性进行判定。（产物定位于细胞膜上）分泌型表示－利用琥珀终止密码（TGA）终止作用，在无琥珀抑制基因菌株中进行表示，形成可溶性抗体。B真核细胞表示用于表示基因工程抗体真核细胞有酵母、昆虫细胞、中国仓鼠卵细胞和真菌等，而且这些细胞表示都是分泌型表示。真核细胞表示抗体方式在病毒病防治和基因治疗上有主要价值。C转基因植物表示即将人Ig基因组转移到植物体内，让植物产生人源化抗体D转基因动物表示即将人Ig基因组转移到动物体内，让动物产生人源化抗体。4抗体库技术噬菌体抗体----90年代初，抗体基因与单链噬菌体外壳蛋白融合并表示于噬菌体表面，以固相化抗原吸附相对应噬菌体抗体，经过屡次吸附－洗脱－扩增，即可得到所需要抗体，称噬菌体抗体。噬菌体抗体库技术特点基因型和表型相统一选择能力和扩增能力相结合噬菌体抗体库构建筛选