化学发光免疫分析技术.pptx

化学发光免疫分析技术第十章化学发光免疫分析技术第三节化学发光免疫分析类型一、直接化学发光免疫分析二、化学发光酶免疫分析三、电化学发光免疫分析四、临床应用发光免疫分析:是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来一个新检测微量抗原或抗体新型标识免疫分析技术。第一节概述放射免疫技术发光:是指分子或原子中电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子过程。依据形成激发态分子能量起源不一样可分为:光照发光、生物发光、化学发光等。光照发光（photoluminescence）是指发光剂（荧光素）经短波长入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，发射出较长波长可见光（荧光）。化学发光（chemiluminescence）是指伴随化学反应过程所产生光发射现象。一些物质(发光剂)在化学反应时，吸收了反应过程中所产生化学能，使反应产物分子或反应中间态分子中电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子形式释放出能量，这一现象称为化学发光。一些化学反应能释放足够能量把参加反应物质激发到能发射光电子激发态，若被激发是一个反应产物分子，则这种反应过程叫直接化学发光。反应过程可简单地描述以下：A十BC*C*C＋h·γ其中γ为光子，C*表示C处于单线激发态。若激发能传递到另一个未参加化学反应分子D上，使D分子激发到电子激发态，D分子从激发态回到基态时发光，这种过程叫间接化学发光。反应过程可表示以下：A十BC*C*十DC十D*D*D十h·γ化学发光效率决定于生成激发态产物分子化学激发效率（φCE）和激发态分子发射效率（φEM）。化学发光反应发光效率、光辐射能量大小以及光谱范围，完全由发光物质性质所决定，每一个发光反应都含有其特征性化学发光光谱和不一样化学发光效率。第二节化学发光剂和标识技术在化学发光反应中参加能量转移并最终以发射光子形式释放能量化合物，称为化学发光剂或发光底物。能作为化学发光剂条件：①发光量子产率高；②它物理-化学特征要与被标识或测定物质相匹配；③能与抗原或抗体形成稳定偶联结合物；④其化学发光常是氧化反应结果；⑤在所使用浓度范围内对生物体没有毒性。㈠直接化学发光剂直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶催化作用，直接参加发光反应，它们在化学结构上有产生发光特有基团，可直接标识抗原或抗体。1.吖啶酯在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长为470nm光，含有很高发光效率，其激发态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系发光体。2．三联吡啶钌三联吡啶钌[RU(bpy)3]2+是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。电化学发光剂反应原理㈡酶促反应发光剂：是利用标识酶催化作用，使发光剂（底物）发光，这一类需酶催化后发光发光剂称为酶促反应发光剂。鲁米诺增强发光反应原理2．AMPPD〔3-(2‘-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷〕〕1.碳二亚胺（EDC）缩正当2.过碘酸钠氧化法3．重氮盐偶联法4.N-羟基琥珀酰亚胺活化法1．发光剂选择2．被标识蛋白质性质3．标识方法选择4．原料比5．标识率6．温度7．纯化与保留第三节化学发光免疫分析类型用吖啶酯直接标识抗体(抗原)，与待测标本中对应抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标识抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂情况下分解、发光。由集光器和光电倍增管接收、统计单位时间内所产生光子能，这个别光积分与待测抗原量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原含量。发光化学发光酶免疫分析（chemiluminescenceenzymeimmunoassay，CLEIA）是用参加催化某一化学发光反应酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标识抗原或抗体，在与待测标本中对应抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标识抗体复合物，经洗涤后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物浓度。该分析系统采取辣根过氧化物酶（HRP）标识抗体(或抗原)，在与反应体系中待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶（HRP）标识抗体复合物，这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发光增强剂使产生化学发光。该分析系统以碱性磷酸酶标识抗体(或抗原)，在与反应体系中待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标识抗体复合物，这时加入AMPPD发光剂，碱性磷酸酶使AMPPD脱去磷酸根基团而发光。分析步骤电化学发光免疫分析（electrochemiluminescen