基于sf9昆虫细胞的蓝光诱导表达系统的构建论文.doc

基于sf9细胞的蓝光诱导表达系统的构建华中农业大学2011届本科毕业论文本科毕业论文(设计)题目基于sf9昆虫细胞的蓝光诱导表达系统的构建ConstructionofBlu-rayInducedExpressionSysteminsf9insectCells姓名蔡泽蕲学号2011304200107学院生命科学技术学院专业班级生科1101指导教师徐富强职称研究员中国·武汉二〇一五年六月华中农业大学学士学位论文基于sf9昆虫细胞的蓝光诱导表达系统的构建ConstructionofBlu-rayInducedExpressionSysteminsf9insectCells学生姓名:蔡泽蕲学生学号:2011304200107学生专业:生物学基地班指导教师:徐富强教授指导小组:吴阳博后华中农业大学生命科学技术学院二〇一五年六月华中农业大学2015届本科毕业论文目录摘要IAbstractIII缩略词表IV1前言11.1诱导型启动子11.1.1天然诱导型启动子11.1.2人工诱导型启动子11.1.3光诱导启动子21.2VP-EL222转录激活系统31.3VP-EL222系统在293T细胞中的表现41.4pMIB/V5-His载体51.5实验背景和目的52.材料与方法62.1实验材料62.1.1材料与试剂62.1.2部分主要试剂的配制62.2实验方法72.2.1sf9细胞的传代培养72.2.2分子克隆基本策略72.2.3通用PCR体系及程序82.2.3酶切体系和方法及胶回收试剂盒的使用82.2.4连接体系及方法92.2.5转化用E.coliDH5α感受态的制备92.2.6转化的步骤92.2.7质粒抽提试剂盒的使用102.2.8质粒DNA的非柱回收简单纯化步骤102.3载体构建流程102.4转染113结果与分析123.1载体鉴定图123.2转染结果123.3结果分析13参考文献15致谢17III摘要光诱导表达系统作为人工诱导表达系统中最璀璨的一员，正受到越来越重要的关注。光作为诱导因子控制基因表达比其它化学因子具有无可比拟的优势，如对时间和空间上的精确把握。尽管如此，当前主要的光控表达系统仍有很多弱点限制着它的应用，比如：蛋白本身的毒性、狭窄的调控范围以及反应缓慢的激活和去激活作用，相比传统的化学诱导表达系统没有压倒性优势。在我们这里将展示一个新的光控表达系统，它没有前述三大缺点，且已被证明广泛的适用性。通过这个系统，我们在多种哺乳动物细胞中测试了光控转录作用。这一方法对在时空上精确控制基因表达是一个强大的工具。本文将讲述这个新的光控表达系统在sf9昆虫细胞蛋白表达中的应用。Sf9昆虫细胞即草地贪夜蛾细胞。Sf9细胞是由G.E.Smith和C.L.Cherry在1983年从细胞株IPLB-SF21AE得来的一个克隆。IPLB-SF21AE是1977年由Vaughn等从草地夜蛾蛹的卵巢组织得到的。sf9细胞属于半贴壁型细胞系，可以进行悬浮培养，也可以进行贴壁培养，在应用于蛋白的表达与制备纯化中，有着许多的优点。Sf9昆虫细胞是杆状病毒表达系统的平台。杆状病毒表达系统(baculovirusexpressionsystem)是近年来应用较多的真核表达系统，它可以在昆虫细胞中表达多种外源基因，包括真菌，植物，细菌，病毒的基因。杆状病毒是一类以昆虫细胞为天然宿主的双链DNA病毒，具有高度的种属特异性，不感染脊椎动物，对人畜无害。目前研究较多的是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcMNPV)。而我们用来构建的这个光控表达系统所使用的载体pMIB/v5-his中的OpIE1和OpIE2正是一个杆状病毒的早期启动子，其中后者是比前者更强的启动子。该杆状病毒是黄杉毒蛾核多角体病毒（OpMNPV），它的天然宿主是道格拉斯冷杉毒蛾。尽管如此，这两个启动子仍然能够在sf9细胞、sf21、LD652Y等多种昆虫细胞中驱动基因表达。杆状病毒早期启动子可以在没有病毒因素的情况下利用细胞转录机制驱动基因表达。因此从某种程度上说，杆状病毒表达载体所具有的优点，我们使用的pMIB载体也同样具有。如：1）表达的重组蛋白能正确折叠，并形成二硫键；2）翻译后可进行修饰加工如糖基化、磷酸化、酰胺化及信号肽切割等，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白；3）与其他华中农业大学2015届本科毕业论文IIII基于sf9昆虫细胞的蓝光诱导表达系统的构建II真核表达系统相比，杆状病毒表达系统可以高效表达外源基因，表达量最高可达被感染昆虫细胞总蛋白量的50％；4）可以容纳大片段外源基因。该系统当前已有实验证明在293细胞中发挥作用，且效果良好，我们计划把它引入到sf9昆虫细胞中。我们的主要工作是构建承载该系统的质粒，然后转染sf9昆虫细胞，获得报告基因的表达情况。在引入这个系统之前我们需要对其进行定性测