医学实验常用方法学简介专家讲座.pptx

研究技术（一）光学显微镜技术（二）电子显微镜技术（三）组织化学术（四）免疫组织化学术（五）原位杂交术（六）细胞和细胞化学定量术（七）组织培养术（八）放射自显影术问题处理方法观察对象太小放大显微镜光线不能透过观察对象切片观察对象缺乏反差染色观察对象生化成份不一样细胞化学免疫组织化学观察对象为生活状态培养（一）光学显微镜技术1、普通光学显微镜2、荧光显微镜3、相差显微镜4、激光扫描共聚焦显微镜（二）电子显微镜技术1、透射电子显微镜2、扫描电子显微镜（三）组织化学术1、多糖2、脂类3、酶4、核酸（四）免疫组织化学术（五）原位杂交术（六）细胞和细胞化学定量术1、显微分光光度测量术2、形态计量术3、流式细胞术（七）组织培养术（八）放射自显影术（一）光学显微镜术lightmicroscope（LM）1石蜡切片①取材Formalin40%,4%②固定BouinFormalin40%25ml苦味酸饱和水溶液75ml冰醋酸5ml③脱水--乙醇、包埋--石蜡④切片6um⑤脱蜡二甲苯→乙醇→水⑥染色HEHematoxylin：核酸RER、RibosomeEosin：蛋白、膜结构（mitochondria、SER、lysosome）⑦透明、封片3、涂片血涂片精液痰液培养细胞4、铺片5、磨片骨和牙需制成磨片、经染色后观察（二）电子显微镜技术电子显微镜（简称电镜）创造和使用，使组织胚胎学研究内容发生了深刻改变。光镜分辨率为0.2um，放大倍数约为1000倍，而电镜分辨率为0.2nm，比光镜高1000倍，可放大几万倍至几十万倍，所以电镜能观察到更微细结构。在电镜下所见结构称为超微结构(ultrastructure)。用于观察细胞内部结构，标本制备比光镜要求更严格，组织块要更新鲜，体积更小（1mm3），固定惯用戊二醛和锇酸。切片则用超薄切片机，制成50~80nm超薄切片，用醋酸铀和柠檬酸铅染色，然后在电镜下观察并摄片。用于观察组织或细胞表面微细结构，标本需经喷镀金属膜特殊处理，然后在扫描电镜下观察，在荧光屏上扫描成像，展现富于立体感表面图像，如细胞表面微绒毛、纤毛和细胞伸出伪足等。2、荧光显微镜（fluorescencemicroscope）由光源、滤光系统和显微镜三个部分组成。光源为高压汞灯，可产生紫外光，标本中自发荧光物质或经荧光素染色或标识结构在紫外光激发下可产生各种颜色荧光，以此来研究该荧光物质在细胞和组织中分布。3、相差显微镜（phasecontrastmicroscope）用于进行细胞培养中活细胞观察，可使无色透明细胞镜下结构反差显著，图像清楚。4、激光扫描共聚焦显微镜（laserscanningconfocalmicroscope）是近年研制和应用一个新型显微镜。它将激光束落在样品上，并作移动扫描，对样品内某种荧光标识物质进行二维和三维动态微量分析测定。可用来研究活细胞内Ca2、Na+和K+等pH值动态改变；细胞内各种细胞器、细胞骨架、核酸、蛋白质和受体等定位和定量分析；细胞膜电位、膜通道及信息传递检测；利用激光对细胞结构或染色体作切割、分离和克隆等逐步成为生物医学研究中主要研究伎俩。（三）组织化学术（histochemistry）应用化学反应与物理反应原理检测组织或细胞内某种化学成份并进行定位、定量及相关功效研究技术。1、多糖显示多糖或蛋白多糖惯用方法是过碘酸—雪夫反应(periodicacidSchiffreaction,PAS反应)。组织或细胞中多糖被结合形成紫红色沉淀物。此反应称PAS阳性反应，PAS阳性部位为多糖存在部位。2、脂类标本用甲醛固定，冷冻切片，用油红O、尼罗蓝或苏丹类染料染色，使组织和细胞中脂类物质显示对应颜色。亦可用锇酸固定兼染色，脂类呈黑色。3、酶酶细胞化学反应基本原理是利用酶对其对应底物水解、氧化等作用，使底物反应产物被某种捕捉剂捕捉并在原位沉淀，形成有色终产物，借此测定该酶在细胞内分布及活性强弱。4、核酸显示DNA传统方法是Feulgen反应（Feulgenreaction），组织切片或细胞涂片先经稀盐酸处理，使DNA水解，醛基暴露，再用雪夫试剂处理，形成紫红色反应产物。（四）免疫组织化学术（immunohistochemistry）利用免疫学抗原和抗体特异性结合原理，检测组织或细胞中多肽和蛋白质等大分子物质分布。为显示抗原抗体复合物存在，需进行抗体标识；用荧光素如异硫氰酸荧光素标识，能够在荧光显微镜下观察，用胶体金标识，能够在电镜下观察，用辣根过氧化酶标识，则可在光镜下或在电镜下观察。惯用方法有直接法、间接法和亲和素-生物素复合物法（ABC法）等。荧光观察（按标本分类）在荧光显微镜下观察标本，当然必须发出荧光，可是大多数标本本身不能发出荧光，因而必须用荧光色素处理过才能发出荧光。（A）自发荧光（B）二次荧光（C）