蛋白质双向电泳及质谱技术专家讲座.pptx

蛋白质双向电泳及质谱技术蛋白质双向电泳技术双向电泳介绍双向电泳详细步骤为何要进行样品制备1确保样品蛋白质完全溶解，分级效果好，干扰原因少尽可能使全部待分析蛋白样品全部处于溶解状态（包含多数疏水性蛋白）。防止样品制备过程中发生样品抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。完全去除样品中核酸和一些干扰蛋白。尽可能去除起干扰作用高丰度或无关蛋白，从而确保待研究蛋白可检测性。经过超离心去除全部颗粒状物质，预防其堵塞凝胶孔路。2最大程度降低样品损失低温保留样品(普通需低于-86℃)尽可能缩短处理时间除盐，省略无须要过程确保样品在聚焦时不发生蛋白聚集和沉淀。样品制备流程及注意事项样品破碎温和破碎法猛烈破碎法作用去除杂质浓缩样品抑制蛋白酶活性关键-可溶性取得能够重新溶解蛋白惯用方法硫酸铵沉淀TCA沉淀丙酮沉淀TCA/丙酮沉淀醋酸铵/甲醇/苯酚抽提样品中杂质去除DNA/RNA去除其它杂质去除样品溶解增加样品溶解性伎俩样品液准备IPG用两亲性电解液组成样品制备注意事项固定pH梯度(IPG)示意图宽pH梯度及窄pH梯度IPG胶重泡涨及上样蛋白载样量第一向：等点聚焦IPG胶条平衡使被分离蛋白质与SDS完整结合胶体考马斯亮蓝染色灵敏度为30~100ng，线性范围是20倍可实现PAGE无背景染色会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析结果胺基黑染色转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）上蛋白质染色转印至硝酸纤维素膜上蛋白质染色银染可降低胶内蛋白质产量对一些种类蛋白质染色效果差对其后蛋白质测序和质谱分析造成影响银染色负染主要包含金属盐染料、锌－咪唑染料等使用能专门提升PAGE胶上蛋白质回收率速度快（5~15min）且能保持蛋白质生物活性不能用于膜上染色适合用于蛋白质显色、完整蛋白质胶上被动提取以及质谱分析胶体扩散染料主要包含印度墨水染料、胶体金属染料等高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和PVDF膜上蛋白质灵敏度与PAGE胶内银染类似不用于胶内染色有机荧光团染料包含共价结合和非共价结合荧光团染料两类，后者最为惯用，其经典代表是已经商品化SYPRORed、Orange、Ruby等荧光染料可对SDS-PAGE胶内蛋白质进行一步染色，约30~60min完成灵敏度为2~10ng其线性范围为3个数量级在Tris/甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白质可被转印至膜上并进行免疫染色或Edman测序来判定蛋白质金属螯合染料与当代蛋白质组学研究相兼容专门与惯用微量化学表征过程兼容不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很轻易和集成化蛋白质组学平台（包含自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等）相结合凝胶图像处理分析当前双向电泳需处理问题对于双向电泳提议蛋白质质谱技术质谱基础质谱评价指标强抗背景干扰能力极高检测灵敏度和准确度可用来分析复杂混合物中蛋白质丰富检测信息，高通量判别蛋白质1、判定和注释蛋白质路线肽质谱指纹图在数据库中匹配不成功可能原因操作中角蛋白或其它蛋白质污染蛋白质发生了较多转译后修饰，数据库中未有记载所用胰蛋白酶质量不够好，蛋白酶自酶解片段多未知新蛋白质数据库规模太小组织切片或印片原位质谱分析技术两级飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF）傅里叶转换盘旋共振质谱（FTMS）表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）2、基于生物质谱定量蛋白质组研究策略3、基于质谱蛋白质相互作用研究方法(1)亲和层析耦联质谱技术先决条件利用含靶蛋白融合蛋白取得相互作用蛋白质主要优点(2)免疫共沉淀耦联质谱技术研究鼻咽癌细胞系中p53相互作用蛋白特点局限性Biacore基于表面等离子共振(SPR)进行生物大分子相互作用分析(BIA)质谱(MALDI-TOF-MS或LC-ESI-MS/MS)判定Biacore芯片上配体所捕捉生物分子Biacore基本工作原理(4)串联亲和纯化耦联质谱技术主要流程↓耦联钙调素亲和柱纯化↓洗脱↓含EGTA洗脱液洗脱↓质谱判定结合蛋白质特点