蛋白类酶的分离纯化专家讲座.pptx

第四章酶分离纯化1、酶分离纯化原因（3条）2、酶分离纯化判定依据－蛋白质物理化学特征（9条）内容细胞结构与酶分布3.1酶提取、分离纯化技术路线酶纯化过程，约可分为三个阶段：(1)粗蛋白质(crudeprotein):采样→均质打破细胞→抽出全蛋白，多使用盐析沉淀法；能够粗略去除蛋白质以外物质。(2)部分纯化(partiallypurified):初步纯化，使用各钟柱层析法。(3)均质酶(homogeneous):目标酶进一步精制纯化，可用制备式电泳或HPLC。3.2细胞破碎许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。1）机械破碎2）物理破碎3）化学破碎4）酶解破碎机械破碎酶提取是指在一定条件下，用适当溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中过程。也称为酶抽提。酶提取时首先应依据酶结构和溶解性质，选择适当溶剂。普通说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多非极性基团，则可用有机溶剂提取。提升温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提升酶分子扩散速度，从而增大提取效果。为了提升酶提取率并预防酶变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。为了使蛋白质充分溶解并保持蛋白质结构与活性，蛋白质提取缓冲液常包含成份酶主要提取方法大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度盐存在条件下，酶溶解度随盐浓度升高而增加，这称为盐溶现象。3.4酶分离方法1、沉淀分离在盐浓度到达某一界限后，酶溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。盐析主要原理在于高浓度盐离子与蛋白质争夺水化水，破坏蛋白质分子表面水化膜，同时因为反离子作用，也影响蛋白质分子所带电荷在一定温度和pH值条件下（β为常数），经过改变离子强度使不一样酶或蛋白质分离方法称为Ks分段盐析；而在一定盐和离子强度条件下（KsI为常数），经过改变温度和pH值，使不一样酶或蛋白质分离方法，称为β分段盐析公式logS=logS0-KsI=β-KsI在蛋白质盐析中，通常采取中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为惯用。这是因为硫酸铵在水中溶解度大而且温度系数小，不影响酶活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子存在会干扰蛋白质测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。在盐析时，溶液中硫酸铵浓度通常以饱和度表示（指溶液中加入饱和硫酸铵体积与混合溶液总体积比值）解读蛋白质工程p204页表7－3有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是因为有机溶剂存在会使溶液介电常数降低。比如，20℃时水介电常数为80，而82％乙醇水溶液介电常数为40。溶液介电常数降低，就使溶质分子间静电引力增大，相互吸引而易于凝集，同时，对于含有水膜分子来说，有机溶剂与水相互作用，使溶质分子表面水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。惯用于酶沉淀分离有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等2、离心分离高速离心机最大转速为（1～2.5）×104r/min，相对离心力到达1×104～1×105g，在酶分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等分离。有些高速离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机超速离心机最大转速达(2.5～12)×104r/min，相对离心力能够高达5×105g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等分离纯化；样品纯度检测；沉降系数和相对分子质量测定等。超速离心有三种：差速离心：采取不一样离心速度和离心时间，使不一样沉降速度颗粒分批分离方法密度梯度离心：使沉降系数比较靠近物质得以分离一个区带分离方法。必须预先配制好适宜密度梯度系统离心前将样品小心地铺放在预先制备好密度梯度溶液表面。（密度相近，分子量不一样）梯度较浅，密度较低等密度梯度离心：分离密度不一样颗粒，欲分离颗粒处于密度梯度中等密度点（平衡）才可停顿离心，操作时先把一定浓度介质溶液与样品液混合均匀。（密度不一样，分子量相近）梯度陡峭，密度较高密度梯度离心前用密度梯度混合器预先配制密度梯度系统，贮液室与混合室截面积关系决定梯度类型。配制中，将稀溶液置于贮液室B，浓溶液置于混合室A,如图4-2(郭勇酶工程p96）流出梯度液经过导管小心搜集于离心管，假如浓溶液置于贮液室B，稀溶液置于A室，梯度液导液管必须直插到离心管管底，让以后流入浓度高混合液将先流入浓度较低混合液顶浮起来形成由管口到管底逐步升高密度梯度超速离心机按照其用途能够分为制备用超速离心机、分析用超速离心机和分析-制备两用超速离心机3种蛋白质分子在离心時，其分子量、分子密度、组成、形状等，均会影响其沉降