蛋白质结构和功能的nmr研究.pptx

蛋白质结构和功能的nmr研究蛋白质NMR研究内容一.确定生物分子溶液三维结构蛋白质溶液三维结构确定技术基础蛋白质溶液三维结构确定主要性二.天然态蛋白质结构－功效研究三.蛋白质复合物相互作用研究Studyofnon-nativeprotein多维NMR研究蛋白质溶液三维空间结构及功效关系NMR方法是确定蛋白质溶液三维结构唯一有效伎俩(1)多维NMR确定蛋白质分子溶液三维结构基础☆核磁共振波谱信息化学位移：氨基酸H、C原子核磁共振峰在α-螺旋与β链中化学位移分布展现规律性差异。J-偶合：反应了肽键二面角(φ，ψ，χ)大小。α-螺旋和β片层二级结构单元中J-偶合数值范围不一样。NOE：核自旋之间偶极－偶极相互作用产生交叉驰豫造成NOE现象，在两个核之间距离小于5Å时能够观察到NOE信号。☆波谱信息与结构信息对应化学位移能够直接用作判别形成α螺旋、β片层氨基酸残基肽段试验依据。J－耦合可用以直接确定肽键二面角φ，ψ，χ。NOE信号强度与两个核之间距离六次方成反比。由NOE强度能够确定两个原子之间距离，在α螺旋与β片层中氢原子之间NOE强度展现不一样特征。可用以准确地测定α螺旋与β片层。由主链原子间远程相互作用提供NOE能够准确地测定蛋白质分子三级折叠。☆多维NMR确定蛋白质分子溶液三维结构流程图NMR研究蛋白质中存在问题小蛋白和大蛋白二维同核NMR谱比较增加NMR波谱维数从二维扩展到四维可提升谱图分辨率1H/13C/15N多维核磁共振波谱示意图单键异核耦适用于磁化强度传递蛋白质分子稳定同位素(13C,15N)标识(2)蛋白质样品准备蛋白质结构和功能的nmr研究(3)基础多维NMR试验三维异核试验脉冲程序：•用于氨基酸残基序列(主链)指认脉冲程序3D1H-15N-13CHNCA,HNCO,HN(CA)CO,HN(CO)CA,HN(CA)HA,HCACO,HCA(CO)N•用于氨基酸残基侧链指认脉冲程序3D1H-15N-13CCBCA(CO)NH,HNCACB,HBHA(CBCACO)NH,CC(CO)NH3D1H-13CHCCH-COSY,HCCH-TOCSY蛋白质结构和功能的nmr研究(4)三维NMR波谱分析Ssh10bCBCA(CO)NH/HNCACB谱K64-K68条带图。从左到右，每个残基CBCA(CO)NH和HNCACB谱图依次相邻。HNCACB谱上浅色峰是负峰。Ssh10bHNCO/HN(CA)CO谱K64-K68条带图。从左到右，每个残基HNCO谱和HN(CA)CO谱依次相邻。Ssh10bHBHA(CO)NH和HBHANH试验，S79－G82条带图。从左到右，每个残基HBHA(CO)NH和HBHANH谱图依次相邻。标是1H，标是1H。在谱上，1H和1H符号相反。Ssh10b残基I76CC(CO)NH和HCCH-TOCSY谱。（A）CC(CO)NH试验15N平面；（B）HCCH-TOCSY试验I76侧链13C各个对应1H-1H平面。CharacteristicsofsecondarystructuralelementsAnti-parallel–pleatedsheet图例-helixAnti-parallel–pleatedsheet&Reverseturn☆确定J-耦合常数HNHA试验15N平面。1H峰在谱图上是负峰。SNase三个片段R1,R2和1H-15NNOE☆确定化学交换☆残余偶极耦合常数确定(5)确定蛋白质结构1.NOE约束2.二面角约束3.取向约束4.氢键约束5.结构计算笛卡儿空间分子动力学模拟退火模拟退火使用简化势能方程，包含维持共价结构经验势能项如键长，键角，二面角，手性，平面性，替换Lennard－Jones和静电非键相互作用简化排斥势，以及试验约束势能项，比如Xplor使用以下力场：扭转角空间分子动力学笛卡儿空间与扭转角空间分子动力学比较☆结构分析金黄色葡萄球菌酶30个结构叠加金黄色葡萄球菌酶140片段结构叠加☆影响蛋白质溶液三维结构正确测定原因蛋白质三维结构与功效1.几个蛋白质NMR三维结构蛇毒蛋白CobrotoxinII蛇毒蛋白CobrotoxinII结构叠加图人白血病细胞调亡相关蛋白质(PDCD5)人翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)人胎儿肝脏新基因(c6orf115)编码蛋白质嗜热古菌核酸结合蛋白Ssh10bNOE分布图示Ssh10b溶液三维结构2.金黄色葡萄球菌酶体外折叠研究对SNase110(1-110残基)片段及其G88W和V66W突变体(G88W110、V66W110)折叠研究G88W110V66W110SNase110SNase110(1-110残基)，SNase121(1-121基)，SNase135(1-135残基)片段折叠路径研究TwoFoldingpathway