蔗糖酶的提取纯化及蛋白质含量测定研究.doc

论文论文题目：蔗糖酶的提取纯化及蛋白质含量测定研究作者姓名周柱林指导教师钟莉学科专业食品科学与工程1102所在学院生物与环境工程学院提交日期2023年12月蔗糖酶的提取纯化及蛋白质含量测定研究周柱林生物与环境工程学院食品科学与工程1102班摘要：对啤酒酵母蔗糖酶的相关性质进行研究讨论，实验采用酵母自溶法初步得到粗蔗糖酶，离心除杂质法得到初提取液A，接着制备热提取液B，接着制备乙醇沉淀提取液C，接着采用QSepharose-柱层析法得到纯度较高的D液，然后用DNS法、标准曲线法和分光光度法测定蔗糖酶的活力，用Folin-酚法测定蔗糖酶蛋白质含量及计算比活力，用微量凯氏定氮法测定总蛋白含量，最后用SDS-PAGE法测定蛋白质的相对分子质量，并对其基本性质进行了研究。实验测定结果A、B、C提取液的酶回收率（％）分别为100、128.5、56.6，蛋白回收率（％）分别为100、98.15、4.29，比活力分别为17.4、22.8、230.1，纯化倍数分别为1、1.31、13.22，SDS-PAGE测定酵母蔗糖酶相对分子质量为A:99150、45000；B：10140；C：92200、65660.关键词：蔗糖酶、提取、纯化、酶活力、蛋白质含量、比活力、相对分子质量1.前言（文献综述）：啤酒酵母也叫营养酵母，可以从其中提取蔗糖酶，蔗糖酶又称为转化酶，属于水解酶类，蔗糖在蔗糖酶的催化下，水解为两种还原糖D一葡萄糖和D一果糖。蔗糖酶在植物的运送贮藏、碳水化合物代谢中发挥重要作用，并在渗透调节、抗逆性生长繁殖、以及信号传导方面也发挥着重要的作用。按水解蔗糖的方式，蔗糖酶可分为从果糖末端切开蔗糖的β-D-呋喃果糖苷酶（β-D-frutofuranosidases,EC3.2.1.26)和从葡萄糖末端切开蔗糖的α-D-葡萄糖苷酶（α-D-glucosidases,EC3.2.1.20)。前者存在于酵母中，后者存在于霉菌中。工业上多从酵母中提取。目前关于酵母中蔗糖酶提取纯化方面的研究较多,有SDS抽提法，正交法等等，其中以甲苯自溶法最为常见。本实验采用此自溶法从啤酒酵母中提取蔗糖酶，运用有机溶剂将胞内蔗糖酶释放，通过初提取的离心去杂和等电位沉淀，制得的粗酶经醇沉后，采用QSepharose-柱层析法纯化，运用DNS法测定其酶活力，运用Folin-酚法测定蛋白质的含量及比活力，运用微量凯氏定氮法测总蛋白氮，以及用SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量，并对其基本性质进行了研究，也为酵母蔗糖酶在食品工业中的应用和蔗糖酶基因工程产品的技术开发提供了实验依据。本实验目的在于用自溶法提取酵母蔗糖酶的过程中，测定各步的总蛋白、总活力，并据此计算比活、回收率和纯化倍数。材料与方法2.1材料：啤酒酵母2.2试剂与仪器2.2.1试剂：醋酸钠；甲苯；95%乙醇；0.5mol/LTris-HClpH7.3缓冲液；4mol/L醋酸；0.05mol/LTris-HClpH7.3缓冲液；1mol/LNaCl的0.05mol/LTris-HClpH7.3缓冲液；0.5mol/LNaOH;Q-Sepharose；DNS；葡萄糖标准溶液；0.2mol/LpH4.6醋酸缓冲液；2mol/LNaOH;5%蔗糖；试剂A（碱性铜试剂）；试剂B（酚试剂）；标准浓度牛血清白蛋白溶液；浓硫酸；硫酸钾3份与硫酸铜1份（质量分数）混合粉末；30%NaOH；2%硼酸溶液；混合指示剂；0.01mol/LHCl标准溶液；30%丙烯酰胺贮液；10%过硫酸铵溶液；分离胶缓冲液贮液；浓缩胶缓冲液贮液；2*SDS-样品缓冲液；SDS-电极缓冲液贮存液；染色液；脱色液。2.2.2仪器:恒温水浴锅,恒温培养箱,高速冷冻离心机、磁力搅拌器或梯度混合器，搅拌子层析柱、梯度发生器及搅拌子、紫外分光光度计、点滴板,电炉,恒温水浴锅,分光光度计721分光光度计,刻度吸管0.5ml（*1），2ml*2，5ml*1,试管1.5cm*15cm（*8）,恒温水浴槽,改良式凯氏定氮仪,DYY-60型电泳仪。2.3实验过程及方法2.3.1蔗糖酶提取及初提纯a.酵母的自溶在250ml锥形瓶中加入鲜酵母20g、醋酸钠1.6g，加入1.5ml甲苯用滤布加牛皮纸将瓶口塞住，摇匀10min，放入37℃培养箱保温60h，使酵母自溶。b.制备初提液A在培养箱中取出装有已自通酵母的锥形瓶，加入10ml蒸馏水，摇匀，倒入塑料离心管中，平衡后用高速冷冻离心机4℃、15000r/min离心10min。小心取出离心后中间层的液体，重新倒入离心管中，4℃、15000r/min离心10min。仔细倒出上层清液，测出体积为VA，取出3ml保存。c.制备热提取液B预先将水浴加热到50℃，将初提液A倒入50ml的锥形瓶中，加4mol/L醋酸3.2ml左右，摇匀，水浴保温2