禽病实验室诊疗专家讲座.pptx

禽病诊疗试验室诊疗一、血清学试验(一)凝集试验1.直接凝集试验凝集反应即细菌、红细胞(Hb)等颗粒性抗原与对应抗体在电解质参加下,抗原颗粒相互凝集形成团块,这种现象称为凝集反应。参加反应抗体称为凝集素,抗原称凝集原。常有平板法、试管法、玻片法及微量凝集法等。(1)平板凝集试验取洁净玻板一块,用蜡笔按试验要求划成数个方格,并注明待检血样号码;用生理盐水倍比稀释血清,加入抗原,用牙签(或火柴棍之类)自血清量最少(血清稀释度最高)一格起,将血清与抗原混匀,注意抗原用前摇匀,并置室内,使其温度达20℃以上。混合完成用酒精灯稍微加温,使达30℃左右,5~8min内统计结果。按以下标准统计反应强度：＋＋＋＋:出现大凝集块,液体完全透明。＋＋＋:有显著凝集片,液体几乎完全透明,即75%凝集。＋＋:有可见凝集片,液体不甚透明,即50%凝集。＋:液体混浊,有小颗粒状物,即25%凝集。－:液体均匀混浊,即不凝集。该法为一个定量方法,惯用于检测待检血清中对应抗体及其效价。如普通以＋＋以上血清最高稀释度为该血清凝集价。也用定性作为禽病阳性判定,帮助临床诊疗及流行病学调查。注意：每次试验须用标准阳性血清和阴性血清作对照。(2)试管凝集试验既可用已知抗原(细菌混悬液)检测待检血清,又可用阳性血清检测待检抗原。①每份血清用4支试管,另取3支对照管。②用0.5%石炭酸生理盐水将被检血清稀释成四个稀释度。第5管中不加血清,设为抗原对照。第6管中加1:25稀释阳性血清0.5ml个阳性血清对照。第7管中加1:25稀释阴性血清0.5ml作为阴性对照。③各管中加入用0.5%石炭酸生理盐水稀释20倍抗原0.5ml,并充分混匀。④放入37℃下作用4~10h,取出后放室温18~24h观察并统计结果。试管凝集试验操作示意表单位:ml(3)玻片凝集法又称快速凝集反应,为一个定性试验,惯用于鸡白痢诊疗及流行病学调查中,也用于鸡传染性鼻炎,鸡慢性呼吸道病(霉形体病)等诊疗。现以鸡白痢玻片凝集试验为例进行示范说明：用滴管吸收标准诊疗液(即鸡白痢凝集标准抗原)一滴(约0.05毫升)滴在洁净玻片或洁净普通玻璃上。刺破鸡冠或翅静脉或剪一鸡冠齿,采血一滴(约0.04毫升),使之与诊疗液混匀,可用牙签或火柴棍搅匀,或稍微靠在桌边缘摇动玻片,频频变动玻板水平位置,使混合均匀。如在1~3min内细菌和红细胞从混合液滴边缘开始逐步凝集成较大颗粒,呈片状、团块状,将红细胞凝集成许多小区,液体几乎完全透明,外观是花斑状,则判为阳性反应;如在2~3min之内不出现凝集现象,而且玻板上混合液均保持原来状态,或者中间部分较浓,四面较稀薄混悬物,则可判为阴性反应。该反应温度条件在室温20~30℃进行。类似还可用血清进行快速凝集反应,其方法为选取洁净玻片或载玻片,下面衬以黑色展板,在玻片上滴一滴血清或相当凝集价稀释血清,再滴一滴鸡白痢凝集标准抗原(诊疗液)混合均匀,几分钟后观察凝集成块情况,判定阴阳反应。如阴性反应,则混和液保持一致混浊红色。(4)微量凝集法该方法原理均同试管凝集法,只是操作在微量滴定板(反应板)上进行,抗原、抗体用量极少,故称微量凝集试验,即用数根稀释棒并排在Ｕ型或Ｖ型微量滴定板上揉搓,将待测血清作系列倍比稀释,随即滴加抗原振荡混合,置37℃温箱或温室内一定时间(12~24h),判定结果方法同平板法。2.间接凝集试验即将颗粒性抗原(或抗体)吸附于与免疫无关小颗粒(载体)表面,此吸附抗原(或抗体)载体颗粒与对应抗体(或抗原)结合,在有电解质存在适宜条件下发生凝集现象。亦称被动凝集试验,惯用载体有动物红细胞,聚苯乙稀乳胶活性炭等,吸附抗原后颗粒称为致敏颗粒。现将最惯用间接血凝试验介绍以下：间接血凝试验是以红细胞为载体,将抗体(或抗原)吸附在红细胞表面,用来检测微量抗原(或抗体),吸附有抗体(或抗原)红细胞也称致敏红细胞。间接血凝试验当前多采取微量法,可选取Ｕ型或Ｖ型微量反应板,将待检血清在血凝板试验用反应板上用稀释棒或定量移液管作倍比稀释,再加等量致敏红细胞悬液,振荡混匀后,置于一定温度数小时或于25~30℃放置过夜,观察凝集程度。以出现50％凝集血清最大稀释度为该血清血凝价。试验应设以下对照:①致敏红细胞加稀释液空白对照;②已知阳性血清对照;③已知阴性血清对照;④未致敏红细胞加阳性血清对照。(二)免疫琼脂扩散试验(AGP)抗原与对应抗体在含有电解质琼脂凝胶中会自由扩散,形成肉眼可见沉淀带称为免疫琼脂扩散试验(沉淀试验)。可用已知抗原沉淀未知抗体,也可用已知抗体测定未知抗原,特异性强,可用于禽流感(AI)、禽霍乱、鸡白痢、马立克(MD)、传染性法氏囊炎(IBD)、传染性支气管炎(IB)、传染性鼻炎(IC)、传染性脑脊髓炎(AE)、病毒性关节炎(REO)、鸡包涵体肝炎(IBH)等诊疗。1.琼脂制备方法