二代测序技术在医学领域中的应用.pptx

二代测序技术在医学领域中应用概要二代测序技术介绍人类基因组HumanGenomeDNA组成末端终止法测序ABI3700(ABI3730)人类基因组计划(HGP)CeleraGenomicsVentor基因组测序降低消耗方法降低消耗方法桥式PCR二代测序（NGS）边合成边测序（SBS）SBS技术特点Hiseq2500常见医学领域NGS方案二代测序应用医疗可行性NGS优势常见医学领域NGS方案常见医学领域NGS方案全基因组重测序是对基因组序列已知个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析方法。伴随基因组测序成本不停降低，人类疾病致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。经过构建不一样长度插入片段文库和短序列、双末端测序相结合策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联常见、低频、甚至是罕见突变位点，以及结构变异等，含有重大科研和产业价值。SNP（个体间差异）CNV（大片段基因拷贝数变异）InDelSV（结构变异）SNP(SNV)示例为何研究SNP？大多数SNP都是无用但也有例外诊疗实例：Dr.JamesGern和JosephDeRisi合作，用MiSeqDx从一个病危十几岁男孩脑脊液中抽提出核酸样本，测了8百万条核酸序列，从中检出了475条钩端螺旋体序列，从而判定这个男孩病是因为钩端螺旋体感染。Dr.JamesGern依据上述判断，给男孩青霉素治疗，治好了这个男孩病。脑脊液是较难取得体液，只能是采集极少量，这就限制了所能得到核酸总量。钩端螺旋体，在病原体常见程度排名中是较靠后种类。在本案例中，假如用PCR方法，挨个排查病原体，可能还没排到钩端螺旋体，核酸就不够了。但高通量测序克服了核酸量不够问题。在本案例中，钩端螺旋体DNA只占总DNA万分之0.6，含量极微，但经过高通量测序，得到了475条钩端螺旋体DNA，这让钩端螺旋体无处循形。年H1N1病毒暴发感染时，有一名病人死于呼吸系统引发多器官衰竭，然而并不知道详细死因。科学家把病人肺部穿刺组织DNA拿来做高通量测序。最终在950万条序列中，含有0.85%序列来自于H1N1病毒基因组，从而帮助科学家发觉了该病人真正死因。在这么高人类基因组干扰背景下，当前其它技术都难以快速发觉致病病毒序列、以及分子分型。Nimblegen(Roche)SureSelect(Agilent)RNAOligoTrusight(Illumina)癌症相关（人）遗传性疾病（人）其它非传染性疾病（人）主要用于寻找罕见突变，遗传性突变及癌症相关体细胞突变能够做SNP，InDel分析，但因为捕捉区域较短，普通不用于CNV，SV分析。成本低（普通50-150X，也仅需要8-15G数据）降低分析背景，轻易发觉稀有突变。大约能测到50-80bp片段缺失，因为外显子捕捉芯片片段较短，极难判断是由捕捉脱靶造成还是由缺失造成。一样因为捕捉芯片片段较短，普通不做CNV，SV分析。WES方案流程包含mRNA-Seq，lncRNA-Seq，sRNA-Seq等。能够高通量分析转录本信息，发觉未知转录本和基因注释。寻找个体间，同一个体不一样时期等感兴趣基因表示丰度改变。mRNA-Seq方案相关lncRNA一些知识：lncRNA-SeqsRNA-SeqRNA-seq优势RNA-seq挑战石蜡包埋样本处理方案FFPE样本(石蜡包埋切片组织)样本量巨大，80%以上临床样本都使用石蜡包埋保留很多宝贵临床样本已经做过组织学，病理学研究，很轻易完成相关试验验证难于抽提，福尔马林处理后DNA轻易产生交联，使提取出DNA量偏低提取出DNA质量低，通常降解200bp-5kb降解程度与石蜡包埋时间相关二代测序技术在医学领域中的应用是否有相同突变?当前无法用于WGRS，样本降解严重，对DNA覆盖度有很大影响。DNA量过少，质量很差。石蜡包埋时间越长，福尔马林对DNA交联和损伤就越大。未使用保护缓冲液处理福尔马林影响更大。CTCS和ctDNA什么是CTCs？CTCs研究意义CTCs研究难点CTCs富集经过细胞形态富集微流芯片密度梯度离心免疫磁珠富集法微流体CTCs判定CTCs与NGS结合ctDNActDNA与NGS结合CTCs与ctDNA分析比较