开发萜烯合酶变体的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103608454103608454A(43)申请公布日2014.02.26(21)申请号201280011458.6(51)Int.Cl.(22)申请日2012.02.01C12N9/88(2006.01)(30)优先权数据61/438,9482011.02.02US(85)PCT国际申请进入国家阶段日2013.09.03(86)PCT国际申请的申请数据PCT/US2012/0234462012.02.01(87)PCT国际申请的公布数据WO2012/106405EN2012.08.09(71)申请人阿迈瑞斯公司地址美国加利福尼亚(72)发明人赵立山徐岚P·韦斯特法尔A·迈恩(74)专利代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所11038代理人罗菊华权利要求书2页权利要求书2页说明书64页说明书64页序列表143页序列表143页附图26页附图26页(54)发明名称开发萜烯合酶变体的方法(57)摘要本公开内容涉及通过经工程改造的宿主细胞开发萜烯合酶变体的方法。具体地，本公开内容提供了开发具有提高的体内性能的萜烯合酶变体的方法，所述萜烯合酶变体可用于萜烯产物的商业生产。在本公开内容中另外包括优良的萜烯合酶变体和包含这样的萜烯合酶变体的宿主细胞。CN103608454ACN1036845ACN103608454A权利要求书1/2页1.一种试验萜烯合酶变体的提高的体内性能的方法，所述方法包括下述步骤：（a）将宿主细胞群分成对照群和试验群；（b）在所述对照群中表达对照萜烯合酶和对比萜烯合酶，其中所述对照萜烯合酶能够将聚异戊二烯基二磷酸转化成第一萜烯，且其中所述对比萜烯合酶能够将聚异戊二烯基二磷酸转化成第二萜烯；（c）在所述试验群中表达试验萜烯合酶和所述对比萜烯合酶，其中所述试验萜烯合酶是所述对照萜烯合酶的变体，且其中所述对比萜烯合酶在所述试验群中和在所述对照群中以类似的水平表达；和（d）在所述试验群中和在所述对照群中测量所述第一萜烯与所述第二萜烯之比。2.根据权利要求1所述的方法，其中通过所述试验群中的所述第一萜烯与所述第二萜烯之比相对于所述对照群中的所述第一萜烯与所述第二萜烯之比的增加，将所述试验群鉴别为包含萜烯合酶变体，所述萜烯合酶变体具有比所述对照萜烯合酶提高的体内性能。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述对照萜烯合酶、对比萜烯合酶和所述试验萜烯合酶是倍半萜合酶，且所述聚异戊二烯基二磷酸是法呢基二磷酸(FPP)。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述对比萜烯合酶是曲古二烯合酶。5.根据权利要求3所述的方法，其中所述对照萜烯合酶和试验萜烯合酶是具有金合欢烯合酶活性的合酶。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述对照萜烯合酶、对比萜烯合酶和所述试验萜烯合酶是单萜合酶，且所述聚异戊二烯基二磷酸是香叶基二磷酸(GPP)。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞包含MEV途径的一种或多种异源酶。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述MEV途径的一种或多种异源酶选自：ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19和HMG1。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述试验萜烯合酶与所述对照萜烯合酶相差1-10个氨基酸。10.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一萜烯与所述第二萜烯之比是至少1.3。11.根据权利要求1所述的方法，其中试验萜烯合酶在所述试验群中的表达水平与所述对照萜烯合酶在所述对照群中的表达水平类似。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述对照萜烯合酶和所述试验萜烯合酶是相同的，但是在所述对照群和所述试验群中以不同的水平表达。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞群是酵母细胞群。14.一种包含2个细胞亚群的组合物，所述2个细胞亚群源自共同的宿主细胞群，其中：（a）所述第一亚群包含对照萜烯合酶和对比萜烯合酶，其中所述对照萜烯合酶将聚异戊二烯基二磷酸转化成第一萜烯，且其中对比倍半萜合酶将聚异戊二烯基二磷酸转化成第二萜烯；（b）所述第二亚群包含试验萜烯合酶和所述对比萜烯合酶，其中所述对照萜烯合酶将聚异戊二烯基二磷酸转化成所述第一萜烯，且其中所述试验萜烯合酶是所述对照萜烯合酶的变体。15.根据权利要求14所述的组合物，其中在所述第二亚群中的所述第一萜烯与所述第2CN103608454A权利要求书2/2页二萜烯之比大于在所述第一亚群中的所述第一萜烯与所述第二萜烯之比。16.一种鉴别具有提高的体内性能的倍半萜合酶变体的方法，所述方法包括下述步骤：（a）将表达对照倍半萜合酶的宿主细胞工程改造成包含高水平的FPP，其中与不包含所述高水平的FPP的亲本细胞相比，所述高水平的FPP降低所述宿主细胞的生存力；（b）在所述宿主细胞