具有高热稳定性的可逆保护的核苷酸试剂.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110099914A(43)申请公布日2019.08.06(21)申请号201780081155.4(74)专利代理机构中国专利代理(香港)有限公司720(22)申请日2017.12.2201代理人任晓华黄希贵(30)优先权数据62/4398512016.12.28US(51)Int.Cl.C07H19/00(2006.01)(85)PCT国际申请进入国家阶段日C12Q1/6844(2006.01)2019.06.27(86)PCT国际申请的申请数据PCT/EP2017/0843372017.12.22(87)PCT国际申请的公布数据WO2018/122157EN2018.07.05(71)申请人豪夫迈·罗氏有限公司地址瑞士巴塞尔(72)发明人A.古普塔权利要求书2页说明书14页附图8页(54)发明名称具有高热稳定性的可逆保护的核苷酸试剂(57)摘要本发明提供了用于通过PCR和RT-PCR(逆转录酶-PCR)进行核酸扩增的稳定核苷酸试剂，其包含修饰的核苷多磷酸。本发明还提供了用于使用修饰的核苷多磷酸用于在扩增反应中检测样品中的靶核酸序列的存在或不存在的方法。CN110099914ACN110099914A权利要求书1/2页1.检测样品中的靶核酸序列的存在或不存在的方法，其包括：a)进行扩增步骤，其包括使所述样品与扩增试剂接触，如果样品中存在所述靶核酸序列则产生扩增产物；和b)检测所述扩增产物，其中所述扩增试剂包含具有以下结构的修饰的核苷多磷酸：-其中B=嘌呤或嘧啶碱基或类似物，L=接头或无，Z=标记物或无，R=OH或O，R1和R2=H或OH，n=1-7，X=O、S或NH，Y=可以化学或酶促除去的有机部分。2.权利要求1的方法，其中X=O且Y=可以通过还原剂化学除去的有机部分。3.权利要求2的方法，其中所述还原剂选自膦衍生物、亚硫酸钠(Na2SO3)、β-巯基乙醇和二硫苏糖醇。4.权利要求3的方法，其中所述膦衍生物是三-(2-羧基乙基)膦(TCEP)。5.权利要求1至4中任一项的方法，其中Y是HO-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-。6.权利要求1至5中任一项的方法，其中X=O且Y=可以通过酯酶酶促除去的有机部分。7.权利要求6的方法，其中所述酯酶是羧酸酯酶。8.权利要求6至7中任一项的方法，其中Y选自CH3C(O)-S-CH2-CH2-和CH2CH2C(O)OCH2-。9.使用扩增试剂扩增靶核酸序列的方法，其中所述扩增试剂包含具有以下结构的修饰的核苷多磷酸：-其中B=嘌呤或嘧啶碱基或类似物，L=接头或无，Z=标记物或无，R=OH或O，R1和R2=H或OH，n=1-7，X=O、S或NH，Y=可以化学或酶促除去的有机部分。10.权利要求9的方法，其中X=O且Y=可以通过还原剂化学除去的有机部分。11.权利要求10的方法，其中所述还原剂选自膦衍生物、亚硫酸钠(Na2SO3)、β-巯基乙醇和二硫苏糖醇。12.权利要求11的方法，其中所述膦衍生物是三-(2-羧基乙基)膦(TCEP)。13.权利要求10至12中任一项的方法，其中Y是HO-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-。14.权利要求9的方法，其中X=O且Y=可以通过酯酶酶促除去的有机部分。15.权利要求14的方法，其中所述酯酶是羧酸酯酶。16.权利要求14的方法，其中Y选自CH3C(O)-S-CH2-CH2-和CH2CH2C(O)OCH2-。17.具有以下结构的修饰的核苷多磷酸：2CN110099914A权利要求书2/2页-其中B=嘌呤或嘧啶碱基或类似物，L=接头或无，Z=标记物或无，R=OH或O，R1和R2=H或OH，n=1-7，X=O、S或NH，且Y选自HO-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-、CH3C(O)-S-CH2-CH2-和CH2CH2C(O)OCH2-。18.权利要求17的修饰的核苷多磷酸，其中Y是HO-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-。3CN110099914A说明书1/14页具有高热稳定性的可逆保护的核苷酸试剂[0001]发明领域本发明提供了稳定的核苷酸试剂、它们的制备方法、它们的使用方法和包含它们的试剂盒。所述核苷酸试剂可用于许多重组DNA技术、特别是通过聚合酶链式反应(PCR)的核酸扩增中。[0002]发明背景核酸扩增试剂通常由温度敏感组分构成，且因此通常必须在远低于环境温度的温度下储存和运输。对于脱氧核苷三磷酸或其核糖核苷三磷酸类似物尤其如此。这些试剂易于经由从末端失去连续的磷酸酯基团而降解，导致形成核苷二磷酸和单磷酸，这二者都不再具有作为核酸聚合酶底物的活性。通过酯化末端磷酸酯可以非常显著地改善核苷多磷酸的稳定性。例如，g-甲基-dNTP类似物在足以完全降