小鼠胚胎成纤维细胞转分化为肝前体细胞的研究.doc

第二军医大学博士学位论文小鼠胚胎成纤维细胞转分化为肝前体细胞的研究ConversionofMouseEmbryonicFibroblastsintoHepaticProgenitorCellsbyDefinedFactors研究生姓名：于兵专业：细胞生物学导师：胡以平教授导师组成员：何志颖副教授李文林副教授第二军医大学基础部二○一二年五月独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文使用授权书声明本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日目录中文摘要…………………………………………………………1Abstract…………………………………………………………3缩略词表…………………………………………………………6前言…………………………………………………………8实验材料…………………………………………………………13一、主要仪器和设备………………………………………13二、主要试制及其制备………………………………………14三、组织标本、细胞系、菌株和表达载体…………………18实验方法…………………………………………………………19一、细胞生物学实验………………………………………19二、分子生物学实验………………………………………28三、动物实验………………………………………31实验结果…………………………………………………………33一、MEF转分化为iHPCs重编程因子的筛选…………33二、Hnf1b和Foxa3诱导MEF转分化为iHPCs…………35三、iHPC的基本生物学特性………………………………38四、iHPCs在体外具有双向潜能………………………44五、iHPC具有再殖损伤肝脏的能力………………………47讨论…………………………………………………………52参考文献…………………………………………………………59附录…………………………………………………………63综述…………………………………………………………66致谢…………………………………………………………79第二军医大学博士学位论文小鼠胚胎成纤维细胞转分化为肝前体细胞的研究-78--79-摘要肝脏移植是治疗终末期肝病唯一有效的手段但器官短缺和免疫排斥限制了该治疗方法的广泛应用。目前肝细胞移植作为原位肝移植的替代方案在临床上取得了一定的疗效。肝干细胞具有较强的增殖能力并可分化为成熟的肝细胞和胆管细胞可为肝细胞移植和组织工程提供大量的供体细胞。最近研究表明通过强制表达组织特异性的转录因子可使一种组织类型的细胞转分化为另一种类型的细胞即谱系重编程（lineagereprogramming）本研究拟通过谱系重编程的方法将小鼠胚胎成纤维细胞（mouseembryonicfibroblastcellsMEF）在体外重编程为肝干/前体细胞。为了诱导MEF重编程为肝前体细胞我选择了决定肝脏发育的重要转录因子以及参与卵圆细胞/肝干细胞动员和状态维持的转录因子共20个转录因子作为候选的重编程因子。以小鼠胚胎发育过程中内胚层最早表达的肝脏分化的分子标志albumin(Alb)、transthyretin(Ttr)、α-fetoprotein(Afp)以及卵圆细胞/肝干细胞的分子标志Ep-Cam、CK19、CK7为标志物来筛选诱导产生的肝前体细胞。以慢病毒为载体诱导MEF转分化为肝前体细胞。首先从20个因子中减去一个因子(即19个因子)的组合来诱导MEF向肝前体细胞分化排除了12个在重编程过程中无明显效应的因子同时确定了8个重编程因子用于下一轮的筛选。用同样的筛选方法最终确定Hnf1b和Foxa3是将MEF转分化为肝前细胞的必要的转录因子。MEF细胞感染Hnf1b和Foxa3因子10天后培