第一讲_高效毛细管电泳法在药物分析中的应用(chaj).ppt

现代仪器分析第一讲:高效毛细管电泳法在药物分析中的应用第一节仪器分析法概述(generalization)其他仪器分析法有：毛细管电泳(CE:CapillaryElectrophoresis)又称高效毛细管电泳(HPCE)是指离子或带电粒子以弹性石英毛细管为分离通道以高压直流电场为驱动力依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的液相分离分析技术。HPCE:以内径10~200µm的毛细管柱为分离通道对大分子和小分子等进行高效分离和检测的有关技术的统称。一、HPCE原理高效毛细管电泳技术上的重要突破毛细管电泳原理示意图二、毛细管电泳的主要模式几种常用的毛细管电泳分离模式CZE中背景电解质的浓度一般高于试样起运载电流的作用其离子有一定的迁移率。当电流通过时缓冲溶液中的阴、阳离子以一特定的速度分别向正极和负极移动。同时试样中的不同离子将按各自的恒定速度移动形成背景电解质离子流动中伴随有试样离子的流动。如果试样中不同离子的迁移率差别很大就能将不同离子分离。带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。正离子：两种效应的运动方向一致在负极最先流出；中性粒子：无电泳现象受电渗流影响在阳离子后流出；BufferConsiderationsTypicalBufferSystems/FSCE(CZE)BufferModifiers(改性剂)forCZE毛细管电泳的几种分离模式(续)缓冲溶液中加入离子型表面活性剂其浓度达到临界浓度形成一疏水内核、外部带负电的胶束。在电场力的作用下胶束在柱中移动。电泳流和电渗流的方向相反且u电渗流＞u电泳负电胶束以较慢的速度向负极移动；中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配疏水性强的组分与胶束结合的较牢流出时间长；（3）毛细管凝胶电泳（CapillaryGelElectrophoresisCGE）在毛细管内填充多孔性凝胶或其它筛分介质将电泳和凝胶色谱分离模式相结合可用于生物大分子的分析如蛋白质和DNA的分子量和碱基数的测定。凝胶具有多孔性类似分子筛的作用试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散所得峰型尖锐分离效率高。蛋白质、DNA等由于其电荷/质量比与分子大小无关CZE模式很难将其分离；而采用CGE能获得良好分离。它是DNA测序的重要手段。特点：抗对流性好散热性好分辨率极高。无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物分子在溶液中的物理缠扰作用代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。是一种根据等电点的差别分离生物大分子的电泳技术。两性物质以电中性状态存在时的pH值称为等电点用pI表示。将被分离的物质和两性电解质混合物装入毛细管在电场作用下不同等电点的两性载体电解质沿毛细管自动形成pH梯度被分离的两性物质各自迁移至其等电点形成很窄的区带分辨率很高。1.CIEF是根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；2.毛细管内充有两性电解质(合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物)当施加直流电压（6～8V）时管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度；3.氨基酸、蛋白质、多肽等所带电荷与溶液pH有关在酸性溶液中带正电荷反之带负电荷。在其等电点时呈电中性淌度为零；4.聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移分别到达满足其等电点pH的位置时呈电中性停止移动形成窄溶质带而相互分离；5.阳极端装稀磷酸溶液阴极端装稀NaOH溶液；6.加压(力)将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测；7.电渗流在CIEF中不利应消除或减小。在毛细管内涂层或在凝胶在中加入亲和配基以亲和力的不同达到分离目的。可用于研究抗原-抗体或配体-受体等特异性相互作用。把毛细管电泳和毛细管液相色谱结合起来的一种分离技术。在毛细管中填充或在毛细管内壁涂布、键合色谱固定相依靠电渗流推动流动相使中性和带有电荷的样品分子根据它们在色谱固定相和流动相之间分配平衡常数的不同和电泳速率的不同而达到彼此分离的目的。毛细管电色谱作为HPLC和CE的融合技术主要有以下特点：（1）采用电渗流EOF驱动（下图）EOF的柱塞流型较HPLC的抛物线流型可以达到更高的柱效。（2）具有色谱和电泳的双重分离机理和选择性既可分离中性分子也可分离带电分子。（3）毛细管电色谱中没有反压问题可以使用更小粒度的填料和更长的毛细管柱因而具有更高的分辨能力。