炎症微环境影响下Wnt信号通路对牙周膜干细胞骨向分化的.pdf

第三军医大学博士学位论文炎症微环境影响下Wnt信号通路对牙周膜干细胞骨向分化的调控机制研究姓名：刘娜申请学位级别：博士专业：生物医学工程指导教师：刘鲁川2011-05第三军医大学博士学位论文炎症微环境影响下Wnt信号通路对牙周膜干细胞骨向分化的调控机制研究摘要目的：干细胞是维持组织器官正常再生能力的重要基础在组织器官创伤缺损中干细胞通过分化促进其再生修复。前期研究已成功从牙周膜组织中分离培养获得了一种新型的成体干细胞即牙周膜干细胞。牙周膜干细胞具有成体干细胞共有的特性具有多向分化能力以及干细胞的自我更行能力它的这些功能使其成为骨再生修复的重要种子细胞。但是慢性炎症疾病中组织的再生修复能力明显下降最新研究显示其原因可能是炎症环境下干细胞再生能力受到明显抑制。牙周炎是一种慢性炎症疾病可造成牙周组织中的牙槽骨以及软组织均受损伤。微环境可以影响干细胞的功能因此我们推测在牙周炎微环境作用下牙周膜干细胞的功能也受到一定的影响牙周组织结构复杂牙周病为主要的炎性疾病因此牙周膜干细胞可作为研究炎症微环境作用下干细胞功能的理想模型。炎症通过改变成体干细胞的微环境产生大量炎症因子来影响内源性干细胞介导的组织再生。炎症因子在骨的损伤及修复过程中发挥重要作用IL-1β和TNF-α在牙周病的进程中发挥关键作用这些炎症因子作用于干细胞后可以引起其下游一系列的变化从而可以改变干细胞的功能。炎症因子干扰正常的成体干细胞后可以引起干细胞分化能力的降低已被证实然而尚无炎症来源干细胞功能的相关报道。因此本实验将首次研究炎症来源的牙周膜干细胞的生物学行为明确炎症微环境对牙周膜干细胞骨向分化的影响。干细胞参与组织再生受多种分子信号通路的调控。牙周炎主要造成牙槽骨的损伤骨再生成为牙周病治疗的关键近期的研究结果表明Wnt经典以及非经典信号通路在骨的发育以及再生过程中发挥重要作用。而炎症微环境中干细胞分化过程的分子通路尚未被阐明极大的阻碍了治疗炎症性疾病新方法和技术的发展。因此拟利用牙周炎来源的牙周膜干细胞作为炎症微环境作用下的细胞模型结合Wnt信号通路在干细胞骨向分化过程中的作用机制探讨炎症微环境影响干细胞再生能力的分子机制并在此基础上进行调控恢复炎症疾病组织来源的干细胞的组织再生能力是本课题着重解决的科学问题。9第三军医大学博士学位论文方法：第一部分:为了获取炎症组织来源的牙周膜干细胞我们首先在临床上进行样本收集收集到相应年龄段内正常因正畸治疗需拔除的健康牙齿炎症来源的则来自于患牙周病且伴牙槽骨吸收因牙周治疗需拔除的患牙。参照正常组织来源牙周膜干细胞(H-PDLSCs)的分离培养方法我们成功获得了炎症组织来源的牙周膜干细胞(P-PDLSCs)。对两种来源的干细胞进行了克隆形成率的检测采用流式细胞仪技术对获得的细胞进行干细胞表面分子标志物的检测。为了比较正常以及炎症组织来源地牙周膜干细胞的功能我们用MTT法以及流式细胞仪进行细胞活性以及生长周期的检测。干细胞具有多向分化能力为了进一步比较两种组织来源的干细胞分化能力差异对两种细胞进行了成脂以及成骨定向诱导分化实验同时采用实时定量PCR对成骨以及成脂的关键基因RUNX2与PPARγ进行检测。第二部分：促炎症细胞因子IL-1β和TNF-α是介导牙周膜干细胞炎症反应的重要炎症介质。为了明确我们获得的牙周膜干细胞在经