一种脱氧核酶切割方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108330151A(43)申请公布日2018.07.27(21)申请号201810131087.4(22)申请日2018.02.09(71)申请人如东百奥百乐生物科技有限公司地址216400江苏省南通市如东县掘港镇街道珠江路888号（如东高新区生命健康产业园）(72)发明人顾宏周(74)专利代理机构上海容慧专利代理事务所(普通合伙)31287代理人于晓菁(51)Int.Cl.C12P19/34(2006.01)C12N9/16(2006.01)权利要求书1页说明书4页序列表5页附图3页(54)发明名称一种脱氧核酶切割方法(57)摘要本发明公开了一种热循环辅助脱氧核酶切割方法，通过升温、降温的热循环步骤，提高反式水解切割DNA的Ι类脱氧核酶的活性(酶在底物间的转换率)的方法，该方法使脱氧核酶I-R3的-1kcat值(酶的催化常数)从0.017min提高到0.5min-1。这种热循环的反应方式可以使脱氧核酶作为一个有力的分子生物学工具，高效的获取单链DNA片段。CN108330151ACN108330151A权利要求书1/1页1.一种脱氧核酶切割方法，其特征在于，包括步骤：1)将I类脱氧核酶反应体系加热至链变性温度，保持一段时间，确保底物链和酶链的充分变性；2)然后温度降至复性和切割温度，使其复性和发生切割反应，保持一段时间。2.如权利要求1所述的脱氧核酶切割方法，其特征在于，重复步骤1)-2)至少一次。3.如权利要求1所述的脱氧核酶切割方法，其特征在于，所述I类脱氧核酶反应体系中底物链过量。4.如权利要求1所述的脱氧核酶切割方法，其特征在于，所述底物为M13mp18基因组。5.如权利要求1所述的脱氧核酶切割方法，其特征在于，所述I类脱氧核酶为I-R3。6.如权利要求1所述的脱氧核酶切割方法，其特征在于，所述I类脱氧核酶具有如SEQNO.5所示的序列。7.如权利要求4所述的脱氧核酶切割方法，其特征在于，所述I类脱氧核酶为E1、E2、E3、E4中的一种或几种，其中E1具有如SEQNO.1所示的序列，E2具有如SEQNO.2所示的序列，E3具有如SEQNO.3所示的序列，E4具有如SEQNO.4所示的序列。8.如权利要求4所述的脱氧核酶切割方法，其特征在于，所述I类脱氧核酶为E1、E2、E3、E4的混合物，其中E1具有如SEQNO.1所示的序列，E2具有如SEQNO.2所示的序列，E3具有如SEQNO.3所示的序列，E4具有如SEQNO.4所示的序列。9.如权利要求1所述的脱氧核酶切割方法，其特征在于，步骤1)中所述的变性温度为65-95℃。10.如权利要求1所述的脱氧核酶切割方法，其特征在于，步骤2)中所述复性和切割温度为37-55℃。11.一种脱氧核酶，其特征在于，所述脱氧核酶具有如SEQNO.5所示的序列。12.一种脱氧核酶，其特征在于，所述脱氧核酶具有选自SEQNO.1、SEQNO.2、SEQNO.3、SEQNO.4中的任意一种序列。2CN108330151A说明书1/4页一种脱氧核酶切割方法技术领域[0001]本发明涉及生物化学与分子生物学领域，尤其涉及进行反式切割的脱氧核酶反应。背景技术[0002]对于蛋白酶，它的催化效率可用酶的转换数(turnovernumber)来表示。蛋白酶的转换数表示酶的催化中心的活性，它是指单位时间(如每秒)内每一催化中心(或活性中心)所能转化的底物分子数，或每摩尔酶活性中心单位时间转换底物的摩尔数。[0003]两个核酸分子之间通过相互作用，由一个分子上的催化中心对另一分子上特异性位点进行切割的过程，称之为反式切割(trans-cleavage)。发生反式切割的脱氧核酶，由于其酶的DNA链和底物的DNA链是通过碱基互补配对紧密结合，反应后底物链与酶的链不会分离，即所谓的产物抑制效应。在产物抑制效应的存在下，只能加入等量或过量酶的DNA链来使全部底物发生切割。[0004]搭建DNA纳米结构时常常需要长的、单链DNA，如果通过化学方法合成，不光现有技术难以实现，而且实验成本很高，而利用脱氧核酶切割基因组得到长的、单链DNA的方法可以使实验成本下降至少3个数量级。现利用脱氧核酶切割基因组获得DNA链的方法，仅仅是通过单转换的切割反应完成的，效率不是很好，而且需要大量的酶的DNA链，实验成本还是较高。发明内容[0005]针对上述技术问题，并且基于对Zn2+依赖的I类脱氧核酶反应速率和最适反应温度的研究，本发明提出了一种热循环过程，辅助一条脱氧核酶去切割多条底物序列，即增加它的转换率，以此来提高反应速率。[0006]本发明首先提供了一种脱氧核酶切割方法，该方法包括步骤：[0007]1)将I类脱氧核酶反应体系加热至链变性温度，保