亚甲基四氢叶酸还原酶基因分型的引物、探针及检测方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115323041A(43)申请公布日2022.11.11(21)申请号202110509216.0(22)申请日2021.05.11(71)申请人深圳泰乐德医疗有限公司地址518057广东省深圳市南山区粤海街道高新中一道16号生物孵化器三期三号楼二楼东侧及四楼、2号楼四楼东侧(72)发明人郭东东任玉冰刘苏珍张娟蔡传良徐希平(51)Int.Cl.C12Q1/6858(2018.01)C12Q1/6883(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表2页附图2页(54)发明名称亚甲基四氢叶酸还原酶基因分型的引物、探针及检测方法(57)摘要本发明提供一种用于亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因分型的LAMP引物组、SNPTaqMan探针及检测方法，依据MTHFR基因C677T突变位点设计LAMP引物组合以及SNPTaqMan特异检测荧光探针，对待测样品恒温孵育后进行熔解曲线分析，从而对MTHFR基因C677T突变位点类型进行分型。本发明还提出所述LAMP引物组合以及SNPTaqMan特异检测荧光探针在制备用于检测MTHFR基因C677T突变位点中的应用。CN115323041ACN115323041A权利要求书1/1页1.MTHFR基因C677T突变位点的检测方法，其特征在于，所述方法为，依据MTHFR基因C677T突变位点设计的LAMP引物组合以及SNPTaqMan特异检测荧光探针，对待测样品恒温孵育后进行熔解曲线分析，进而鉴定MTHFR基因的野生型、纯合突变型和杂合型中的任意一种。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述LAMP引物组合为：正向外引物F3:5'‑GGAGCTTTGAGGCTGACCT‑3'；反向外引物B3:5'‑GTGAGAGTGGGGTGGAGG‑3'；反向环引物LB:5'‑CCATCGTCCCCGGGATCTTTC‑3'；正向内引物FIP:5'‑GCGGAAGAATGTGTCAGCCTCAAGCACTTGAAGGAGAAGGTG‑3'；反向内引物BIP:5'‑ACCGACATGGGCATCACTTGCGAGCTTATGGGCTCTCCTGG‑3'。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述SNPTaqMan特异检测荧光探针为：SNPTaqMan探针：荧光基团5'‑TGAAATCGGCTCCCGCAGA‑3'淬灭基团。4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述SNPTaqMan特异检测荧光探针5'端所使用的荧光基团为适用于SNPTaqMan熔解曲线分析的荧光报告基团，包括FAM、VIC、TET、HEX和ROX中的任意一种；SNPTaqMan特异检测荧光探针3'淬灭的基团为BHQ和TAMRA任意一种。5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，还包括LAMP反应体系。6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述LAMP反应体系包括：LAMP缓冲液、dNTPs、BstDNA聚合酶、Betaine、LAMP特异性扩增引物、SNPTaqMan特异检测荧光探针、去离子水。7.含有权利要求2～6任一项所述的检测方法，其特征在于，包括步骤：步骤一：取待检样本抽提的DNA为模板；步骤二：利用如上所述的LAMP检测液分别对DNA模板进行LAMP扩增，增加MeltCurve程序；步骤三：结果判定：依据熔解曲线的结果来得到待检测样本MTHFRC677T基因位点的基因型。8.根据权利要求7所述的检测方法的使用方法，其特征在于，所述LAMP反应扩增反应的条件为：60‑65℃恒温孵育30‑60min。其后增加MeltCurve熔解曲线分析步骤。熔解曲线分析的条件为：先降至低温(如35℃)，以一定升温速率(如0.08℃/s)升温至高温(如95℃)，每秒采集SNPTaqMan特异检测荧光探针对应荧光基团荧光(如FAM荧光)。2CN115323041A说明书1/5页亚甲基四氢叶酸还原酶基因分型的引物、探针及检测方法技术领域[0001]本发明涉及基因突变位点检测技术领域，具体涉及一种用于亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因分型的LAMP引物组、SNPTaqMan探针及检测方法。背景技术[0002]亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenete‑trahydmfolatereductase,MTHFR)是叶酸代谢过程中的关键酶，其催化与还原型辅酶I(NADPH)相关的5,10‑二甲基四氢叶酸转化为5‑甲基四氢叶酸。MTHFR的调控作用主要是DNA的合成、活化及修复。神经管缺陷、癌症、心脑血管疾病等多种病症可由MTHFR基因的缺陷导致。[0003]基因多态性是指核苷酸序列上发生转换、颠倒、插入或缺失，其群体频率≥