宏基因组文库的保存和筛选方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN101967683A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN101967683A(43)申请公布日2011.02.09(21)申请号201010297594.9(22)申请日2010.09.30(71)申请人中国科学院昆明植物研究所地址650204云南省昆明市蓝黑路132号(72)发明人曾英付小莉王浩鑫(74)专利代理机构云南协立专利事务所53108代理人马晓青(51)Int.Cl.C40B30/00(2006.01)C40B40/08(2006.01)C12N7/00(2006.01)权利要求书1页说明书3页(54)发明名称宏基因组文库的保存和筛选方法(57)摘要提供一种宏基因组文库的保存和筛选方法，一是快速有效地保存海量宏基因组克隆的方法，包括用小量的文库包装颗感染一定量的感受态细胞，等分成96份或96的整倍数，进行文库扩增培养与保存；二是通过对同一张膜上的文库DNA模板用不同探针进行多次杂交以提高宏基因组文库筛选效率的方法，包括用一定温度的碱性溶液去除杂交膜上的探针，同时保留膜上的DNA模板用于不同探针的多次膜杂交，从而提高宏基因组文库的筛选效率。CN1096783ACN101967683A权利要求书1/1页1.宏基因组文库的保存和筛选方法，其特征在于所述宏基因组文库的保存是用小量的文库包装颗料感染感受态细胞，保温后将其等分成96份或96的整倍数，振荡培养，加入甘油保存；所述宏基因组文库的筛选是用氢氧化钠加十二烷基磺酸钠溶液漂洗杂交膜，去除探针的同时保留膜上的DNA模板用于不同探针的多次膜杂交。2.根据权利要求1所述的宏基因组文库的保存和筛选方法，其特征在于所述宏基因组文库的保存是取1～100微升的文库包装颗粒与1～10毫升感受态细胞混匀，25～39℃保温20～60分钟，将该细胞混合物等分成96份或96的整倍数，每份加0.2-2mlLB培养液，所述LB培养液为胰蛋白胨10克/升+酵母提取物5克/升+氯化钠5克/升，pH7.0，在28～39℃振荡培养12～24小时，加入甘油保存；所述宏基因组文库的筛选是把已进行过探针杂交的杂交膜放入预热的0.2M氢氧化钠加以重量/体积即克/100ml为单位的0.1％的十二烷基磺酸钠溶液中，在37℃、55℃、68℃漂洗两次，每次10分钟、20分钟、30分钟，然后用300mM氯化钠加30mM柠檬酸钠溶液彻底漂洗，去除探针的同时保留膜上的DNA模板用于不同探针的多次膜杂交。3.根据权利要求1所述的宏基因组文库的保存和筛选方法，其特征在于感受态细胞的获取是挑取前一天划线培养的EPI300单克隆至5毫升LB培养基中，37℃下每分钟200转培养12小时；按1∶10的比例转接至15毫升新鲜添加了10mM硫酸镁的LB培养液中，37℃下每分钟200转培养100分钟使细胞密度达到OD600约0.9，由此获得感受态细胞。4.根据权利要求1所述的宏基因组文库的保存和筛选方法，其特征在于已进行过探针杂交的杂交膜分两次在68℃中处理30分钟能完全去除探针，将去除探针的杂交膜用不同探针再进行多次杂交。2CN101967683A说明书1/3页宏基因组文库的保存和筛选方法[0001]所属领域：本发明属于微生物工程领域，涉及一种快速有效地保存并筛选海量宏基因组克隆的方法，也就是高效保存和筛选宏基因组文库的方法。[0002]背景技术：宏基因组是指环境中可培养和未可培养的全部微生物的基因组总和，宏基因组文库技术避开了微生物纯培养的瓶颈，是研究和利用微生物、尤其是未可培养微生物资源的有效途径。将常规的基因组文库技术用于宏基因组研究中，通过直接提取环境样品中所有微生物的DNA并克隆到合适的载体，即可获得宏基因组文库。根据插入片段大小，宏基因组文库可以被分成两类：一是克隆于质粒载体或λ噬菌体载体中的小片段文库(插入片段小于15000碱基对)；另一类是克隆于粘粒及BAC中的大片段文库(插入片段大于30000碱基对)。为了最大程度地涵盖感兴趣的所有微生物，宏基因组文库的容量通常在一百万个克隆以上，对于如此海量的宏基因组文库克隆群体，有必要发明一种快速有效的保存和筛选方法。宏基因组文库的传统保存方法包括挑取单个克隆、每8个或更多个单克隆合并保存，这一方法不仅费时费力，而且需要占用很大的保存空间。此外，基于序列相似性用探针进行分子杂交常用于宏基因组文库的筛选，但是，对同一张膜上的DNA模板用不同探针进行多次膜杂交以提高宏基因组文库筛选效率的方法，还未见报道。[0003]发明内容：本发明的目的是克服上述已有技术的局限，提供一种高效保存和筛选宏基因组文库的方法。[0004]为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：[0005]宏基因组文库的保存和筛选方法，所述宏基因组文库的保存是用小量的文