表达O型口蹄疫病毒VP1基因的重组布鲁氏菌及其疫苗的生产方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN101979502A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN101979502A(43)申请公布日2011.02.23(21)申请号201010504354.1C12N15/42(2006.01)(22)申请日2010.10.13C12N15/63(2006.01)A61K39/295(2006.01)(83)生物保藏信息A61K39/135(2006.01)CGMCCNo.41932010.09.27A61K39/10(2006.01)(71)申请人中国兽医药品监察所A61P31/04(2006.01)地址100081北京市海淀区中关村南大街8A61P31/14(2006.01)号C12R1/01(2006.01)(72)发明人丁家波支海兵彭小兵王楠李旭妮戴志红(74)专利代理机构北京君智知识产权代理事务所11305代理人郑明(51)Int.Cl.C12N1/21(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表3页附图0页(54)发明名称表达O型口蹄疫病毒VP1基因的重组布鲁氏菌及其疫苗的生产方法(57)摘要本发明涉及表达O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因的重组布鲁氏菌及其疫苗的生产方法。该重组菌株通过在布鲁氏菌S2株菌基因组中稳定地整合进O型FMDV缅甸株(Mya)的VP1基因，并同时破坏了光滑型布鲁氏菌细胞壁LPS结构中O链形成的条件，使重组菌由光滑型转变为粗糙型，使菌株的安全性进一步提高，但仍保留了对布鲁氏菌病良好的免疫效果，该重组菌被命名为重组布鲁氏菌rS2-Mya株。该重组菌能够表达O型FMDVMya株VP1蛋白，并诱导相应抗体产生，对O型FMD有良好的基础免疫作用。以此菌株生产疫苗将改变布鲁氏菌疫苗免疫动物与野毒株感染动物难以区分的现状，同时实现了FMD疫苗的细胞免疫，并将为布鲁氏菌病和FMD的防控提供了一种良好的疫苗。CN109752ACCNN110197950201979507A权利要求书1/1页1.一种表达O型口蹄疫病毒VP1基因的重组布鲁氏菌，其特征在于采用非抗性筛选技术，用密码子优化的O型缅甸株VP1基因替代布鲁氏菌S2菌株wboA基因1～897bp之间的序列，构建能够表达O型FMDVVP1基因的重组布鲁氏菌rS2-Mya株，该重组菌不仅能够良好地表达O型VP1基因，而且使原始菌株由光滑型转变为了粗糙型，用该菌制备的疫苗免疫动物后，实现对布鲁氏菌病和O型FMD的双重免疫，其血清可用常规的凝集试验与自然感染相区分，本菌株已于2010年9月27日送交中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为：CGMCCNo.4193。2.一种表达O型口蹄疫病毒VP1基因的重组布鲁氏菌活疫苗的生产方法，其特征在于用胰大豆肉汤作为重组菌疫苗制造用培养基，培养基灭菌后按培养基量的按1％～2％接入布鲁氏菌rS2-Mya株种子菌液，37℃，按常规方法发酵培养28～38h，加入兽用生物制品常用的蔗糖明胶稳定剂，充分混匀、分装疫苗瓶中后经冷冻真空干燥，即成为重组O型口蹄疫-布鲁氏菌rS2-Mya活疫苗。3.一种表达O型口蹄疫病毒VP1基因的重组布鲁氏菌活疫苗的生产方法，其特征在于用于布鲁氏菌S2菌株疫苗生产用培养基均可作为本发明的疫苗生产用培养基。2CCNN110197950201979507A说明书1/7页表达O型口蹄疫病毒VP1基因的重组布鲁氏菌及其疫苗的生产方法[0001]所属技术领域本发明涉及牛、羊和猪对布鲁氏菌病和口蹄疫两种传染病的预防用活疫苗，属兽用生物制品领域。技术背景[0002]布鲁氏菌病(布病)是由布鲁氏菌或称布鲁氏菌(Brucella)引起的以流产和发热为特征的人兽共患病，严重地威胁着人和多种动物的生命健康。本病不但对动物的繁殖和生产性能具有严重危害，更重要的是，人感染布鲁氏菌后，往往难以治愈，从而造成严重的公共卫生问题。因此在布鲁氏菌流行的国家，消除布病一直是公共卫生计划中最重要的目标之一。目前全世界范围内消除该病的主要方法是扑杀与免疫相结合，对布病发生相对比较严重的中国，由于扑杀的成本高，疫苗预防成为本病主要控制手段。[0003]布鲁氏菌疫苗免疫带来的主要问题是无法区分疫苗免疫和自然感染的动物，这在很大程度上限制了布鲁氏菌疫苗的使用和推广，也给布病的有效防治和清除带来了一定的难度。[0004]布鲁氏菌存在光滑型(S)和粗糙型(R)两类不同表型的菌株，在凝集类抗体水平上无交叉反应，因此用粗糙型布鲁氏菌疫苗免疫的动物，其血清只与粗糙型抗原发生凝集反应，而与光滑型血清不反应，以此可以区分疫苗株和野毒株。最早使用过的粗糙型布鲁氏菌疫苗是用45/20菌株制备的，但该菌株极不稳定，经常会出现从R型到S型的变异，造成毒力返强，因而该疫苗已基本不再使用。90年代美国科学家通过