骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的诱导方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN103013916A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN103013916A(43)申请公布日2013.04.03(21)申请号201210504994.1(22)申请日2012.11.30(71)申请人陆华地址214041江苏省无锡市第三人民医院神经外科组(72)发明人陆华(74)专利代理机构常州市维益专利事务所32211代理人何学成(51)Int.Cl.C12N5/079(2010.01)权利要求书权利要求书1页1页说明书说明书33页页附图附图11页(54)发明名称骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的诱导方法(57)摘要本发明提出一种骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的诱导方法，包括分离培养细胞，间充质干细胞的形态学观察，流式细胞仪检测抗原表达，诱导分化实验以及细胞免疫荧光染色。所述方法应用全反式维甲酸、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞，不仅具有了神经细胞的典型形态，并表达神经元标志抗原神经元特异性烯醇化酶、星型胶质细胞标志抗原胶质纤维酸性蛋白；提示骨髓间充质干细胞保留了跨胚层分化为非间充质细胞的能力，可跨胚层分化为神经元样细胞，有望成为神经细胞替代治疗的种子细胞。CN10396ACN103013916A权利要求书1/1页1.一种骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的诱导方法，其特征在于，其应用全反式维甲酸、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞，所述诱导方法包括如下步骤：分离培养细胞，BMSCs的形态学观察，流式细胞仪检测抗原表达，诱导分化实验以及细胞免疫荧光染色；其中，所述的分离培养细胞步骤具体为：在无菌条件下收集骨髓，肝素抗凝收集的骨髓悬液，D-Hanks液稀释，缓慢加在一半体积的Ficoll分离液上，600g离心15分钟，收集界面层细胞，用D-Hanks液洗1遍，调整细胞浓度为1×105/ml，接种于25cm2的培养瓶，在饱和湿度静置培养，当细胞密度达到70％融合后用0.25％的胰蛋白酶消化，按照1瓶分2瓶的比例传代培养；所述的BMSCs的形态学观察步骤具体为：在倒置相差显微镜下每日观察原代和传代细胞的生长情况和形态特征，并摄片记录；所述的流式细胞仪检测抗原表达步骤具体为：取2-3代培养细胞用0.25％的胰蛋白酶消化后，用含1％小牛血清白蛋白PBS液调整细胞至5×106/ml；取50ul细胞悬液，分别加入下列鼠抗人单克隆抗体：CD34-FITC、CD45-PE、CD29-FITC、CD44-PE、CD105-FITC、CD106-FITC，置4℃孵育30分钟，PBS洗2次，进行流式细胞仪分析；所述诱导分化实验的步骤具体为：取2-3代培养细胞，分别接种于6孔板，生长密度达到60％时，换成诱导培养基，在37℃、5％CO2下饱和湿度静置培养；以及所述细胞免疫荧光染色的步骤具体为：培养细胞在诱导分化3天后采用免疫荧光染色。2.如权利要求1所述的骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的诱导方法，其特征在于，所述的分离培养细胞步骤中培养瓶中的培养基为DMEM-LG+1％Penicillin-Streptomycin+10％FBS。3.如权利要求1所述的骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的诱导方法，其特征在于，所述的诱导分化实验步骤中所述诱导培养基为DMEM+10％FBS+1μmol/LATRA+20ng/mlbFGF+20ng/mlEGF。2CN103013916A说明书1/3页骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的诱导方法技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的全反式维甲酸联合细胞因子诱导方法。背景技术[0002]虽然骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植治疗缺血性脑损伤固然已取得了一定的进展，但BMSCs移植后神经细胞转化率在体外可高达80％，在体内仅为3％～10％，而且在体内环境下分化为神经胶质细胞的比率较大而分化为神经元样细胞的比率较小，这无疑会给神经系统功能的恢复带来不利因素。如果能将骨髓基质细胞在体外分化为神经元样细胞，再行细胞移植会有事半功倍的效果。[0003]中胚层来源的BMSCs向外胚层来源的神经元分化的研究正处于起步阶段。全反式维甲酸是维生素A的衍生物，能够明显增加神经细胞的数量并呈剂量依赖效应，能调节EGF反应的神经干细胞分化，增加神经元细胞和星形胶质细胞的合成。将其与神经营养因子和细胞因子联合用于诱导胚胎干细胞向神经干细胞方向分化，同体内发育过程相似，且可以部分模拟体内环境，因此日益受到重视。但是，这些研究多停留在诱导后BMSC具有神经元形态特征和表达神经细胞标记物水平上，而缺乏具有神经细胞生理学特性的证据，因此许多学者认为这类细胞被称为