一种基于微球和微柱阵列芯片的乳滴数字PCR定量方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105838801A(43)申请公布日2016.08.10(21)申请号201610297439.4(22)申请日2016.05.06(71)申请人中国科学院上海微系统与信息技术研究所地址200050上海市长宁区长宁路865号5号楼505室(72)发明人毛红菊程祖乐王琨夏文薇金庆辉赵建龙(74)专利代理机构上海泰能知识产权代理事务所31233代理人黄志达魏峯(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表1页附图2页(54)发明名称一种基于微球和微柱阵列芯片的乳滴数字PCR定量方法(57)摘要本发明涉及一种基于微球和微柱阵列芯片的乳滴数字PCR定量方法，包括：(1)制备微柱阵列芯片；(2)抽取表面修饰链霉亲和素的聚苯乙烯微球，稀释后分步加入到目标磁珠的悬浊液中孵育，富集微球磁珠复合物，重悬；(3)取步骤(2)中的微球磁珠复合物的重悬液，通入到装置中冲洗，通过统计芯片上截留的微球磁珠复合物，得到目标磁珠的个数，从而达到对核酸高灵敏定量的目的。本发明芯片组装简单，成本低；在保留了BEAMing实验高灵敏度特点的同时使得BEAMing技术的目标磁珠计数方法更加方便易行，为核酸的高灵敏检测提供了一个简便、快速的实用工具。CN105838801ACN105838801A权利要求书1/1页1.一种基于微球和微柱阵列芯片的乳滴数字PCR定量方法，包括：(1)将硅片清洗、涂胶后采用深反应离子刻蚀在硅片上刻蚀出微柱阵列，微柱阵列之间的间距随行数减小，采用等离子去胶工艺去除残胶后得到硅片模具；将硅片模具硅烷化，将配制好的PDMS浇筑在硅片模具上，PDMS加热固化后剥离即得到微柱阵列芯片；(2)抽取表面修饰链霉亲和素的聚苯乙烯微球，稀释后分步加入到BEAMing实验中生物素修饰的目标磁珠的悬浊液中孵育，富集微球磁珠复合物，重悬；(3)取步骤(2)中的微球磁珠复合物的重悬液，通入到微柱阵列芯片中冲洗，通过统计芯片上截留的微球磁珠复合物，得到目标磁珠的个数。2.根据权利要求1所述的一种基于微球和微柱阵列芯片的乳滴数字PCR定量方法，其特征在于：所述步骤(1)中的清洗为采用体积比10:1的H2SO4/H2O2清洗溶液清洗。3.根据权利要求1所述的一种基于微球和微柱阵列芯片的乳滴数字PCR定量方法，其特征在于：所述步骤(1)中微井阵列之间的间距变化范围为50～6μm。4.根据权利要求1所述的一种基于微球和微柱阵列芯片的乳滴数字PCR定量方法，其特征在于：所述步骤(2)中聚苯乙烯微球的直径比微柱阵列最小间距大，目标磁珠的直径比微柱阵列最小间距小。5.根据权利要求1所述的一种基于微球和微柱阵列芯片的乳滴数字PCR定量方法，其特征在于：所述步骤(2)中的重悬为采用PBST溶液重悬。6.根据权利要求5所述的一种基于微球和微柱阵列芯片的乳滴数字PCR定量方法，其特征在于：所述PBST溶液的组成为pH7.4的PBS溶液和0.01％Tween20。7.根据权利要求1所述的一种基于微球和微柱阵列芯片的乳滴数字PCR定量方法，其特征在于：所述步骤(3)中的冲洗为采用PBST溶液冲洗。2CN105838801A说明书1/5页一种基于微球和微柱阵列芯片的乳滴数字PCR定量方法技术领域[0001]本发明属于乳滴数字PCR领域，特别涉及一种基于微球和微柱阵列芯片的乳滴数字PCR定量方法。背景技术[0002]聚合酶链式反应(PCR反应)是现代分子生物学实验的核心技术，其特异性扩增目的核酸片段的方法提高了核酸分子检测的灵敏度，在诸多生物研究和疾病诊断中起着重要的作用。根据PCR反应扩增原理衍生出了许多核酸定量技术，其中BEAMing(beads,emulsion,amplification,andmagnetics)是一种基于磁珠固相扩增的乳滴数字PCR技术[D.Dressman,H.Yan,G.Traverso,et.al.,TransformingsingleDNAmoleculesintofluorescentmagneticparticlesfordetectionandenumerationofgeneticvariations[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2003,100:8817-8822]。其基本流程是将修饰有引物的磁珠和单个靶标分子单独包裹在一个油包水腔体中，靶标分子在磁珠表面进行复制，之后对乳滴破乳，收集磁珠并与统计有核酸扩增的磁珠个数。通过扩增反应，BEAMing可以将单个靶标分子转化为单个磁珠表面上的上万个靶标分子拷贝，放大了靶标分子的信号。由于单个靶标分子仅在一个磁珠表面进行扩增，一个