葛根素诱导破骨细胞自噬的机制研究.docx

葛根素诱导破骨细胞自噬的机制研究[摘要]目的观察葛根素（Pur）对破骨细胞自噬的影响探讨其诱导破骨细胞自噬的机制。方法采用骨髓干细胞分化的方式培养原代破骨细胞并按加入Pur量的不同分成10、50、100μg/L的Pur组和空白对照组采用免疫印迹技术（Western-Blot）检测提取的自噬相关蛋白及Akt-mTOR通路相关蛋白的表达。结果①10、50、100μg/L浓度的Pur组与空白对照组比较其膜型与胞质型微管相关蛋白1轻链3的比值（LC3Ⅱ/Ⅰ）均升高（P<0.01）；10、100μg/L浓度的Pur组与对照组比较p62蛋白消耗均增加（P<0.05）。②10、50、100μg/L浓度的Pur组与空白对照组比较酸化核糖体蛋白（p-s6）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）均消耗增多（P<0.05）。结论Pur能够促进破骨细胞自噬Akt-mTOR通路或许是Pur诱导破骨细胞自噬的机制之一。[关键词]葛根素；破骨细胞；自噬；Akt-mTOR通路[中图分类号]R285.5[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2015）05（c）-0020-04[Abstract]ObjectiveToinvestigatethesignalingpathwayofpuerarinonosteoclaststhroughautophagy.MethodsOsteoclastswerederivedfrombonemarrowstemcellsanddividedintofourgroupsbasedonthetreatedwithdifferentconcentrationofpuerarin（01050100μg/Lgroups）.ExpressionofLC3Ⅱ/Ⅰp62Aktp-Aktandp-s6wereanalyzedbyWestern-Blot.Results①IncreasedLC3Ⅱ/Ⅰlevel（1050100μg/Lgroups）anddecreasedp62expression（10100μg/Lgroups）wereobservedinpuerarin-treatedgroupscomparedwithnormalgroup（P<0.01orP<0.05）.②Puerarininhibitedtheexpressionofp-AktAktandp-s6（P<0.05）.ConclusionPuerarincanpromotetheautophagyofosteoclastsandmayregulateviaAkt-mTORsignalingpathway.[Keywords]Puerarin；Osteoclasts；Autophagy；Akt-mTORsignaltransductionpathway葛根在最早的药学著作《神农本草经》中便有记载因其能治疗“诸痹”等作用而成为治疗骨质疏松症的一味常用而有效的中药它可增加骨密度和骨量改善骨构造而达到治疗作用[1-2]。近年来研究显示中药葛根在防治骨质疏松症的体内外实验方面都取得了良好的效果而葛根素（puerarinPur）在葛根的提取物异黄酮类化合物中含量最高是其特有的主要有效成分因此Pur的作用机制研究成了研究葛根的热点领域[3]。Pur能够促进成骨细胞形成与分化[4]增加血清碱性磷酸酶（ALP）的表达[5]而且有文献提出Pur还能对破骨细胞的活性产生一定的抑制作用[6]。在分子水平上有文献指出Pur能通过促进自噬作用来保护1-甲基-4-苯基-吡啶离子（MPP+）诱导的人神经母细胞瘤细胞损伤[7]。另外有研究提出破骨细胞自噬水平的提高会对其活性及分化过程起负向调控作用[8]但其具体机制尚未明确。本研究通过观察不同浓度Pur组和不加入Pur的对照组对破骨细胞自噬的影响探究其自噬的相关信号通路旨在从分子水平上探讨Pur对破骨细胞自噬的作用机制。1材料与方法1.1实验动物2月龄不分雌雄的昆明（KM）小鼠无特定病原体（SPF）级由广东省中医院实验动物中心提供。1.2主要试剂及仪器葛根素（阿拉丁公司批号：CAS3681-99-0）；α-MEM培养基、胎牛血清和青链霉素（美国Hyclone公司）；BCA蛋白质定量测定试剂盒（美国Thermo公司