羟基磷灰石涂层材料制备论文.docx

羟基磷灰石涂层材料制备论文〔摘要〕目的：观察含镧羟基磷灰石作为涂层材料的细胞相容性。方法：将原代培养的成骨细胞接种到涂层表面采用细胞计数观察第1、7、14、21天细胞在材料表面的附着、增殖情况采用SEM观察细胞在材料表面的形态变化并且对21d内细胞的碱性磷酸酶活性进行检测。结果：成骨细胞在材料表面的细胞增殖数与对照组间无显著性差异细胞在材料表面伸展良好粘附牢固并具有良好的细胞形态及增殖率碱性磷酸酶活性逐渐增加。结论：含镧羟基磷灰石涂层材料具有良好的细胞相容性。关键词镧；羟基磷灰石类；涂层；成骨细胞；碱性磷酸酶钛合金表面的生物陶瓷涂层以其优良的生物学性能已作为种植体材料广泛应用于临床目前常用的涂层材料为羟基磷灰石（HA）但已有文献报道由于涂层工艺及HA稳定性的问题使HA涂层在体内迅速溶解而导致种植体的失败〔12〕。本研究在HA中添加了稀土元素镧使其晶体更加稳定〔3〕同时采用新的涂层工艺使其在钛合金表面形成稳定和牢固的涂层。在对该涂层材料的细胞毒性进行研究的基础上〔4〕为进一步观察用含镧羟基磷灰石涂层后材料的细胞相容性本实验在体外研究了该涂层材料与成骨细胞间的相互作用为进一步的体内研究提供了理论和实验依据。1材料与方法1.1含镧羟基磷灰石涂层材料的制备在直径为10mm厚1.5mm的钛表面制备含镧羟基磷灰石涂层材料La-HA（西安交通大学金属材料强度实验室提供）将涂层圆片用体积分数(φ)为75%乙醇超声振荡清洗后再用三蒸水超声振荡清洗3遍烘干60Co辐射灭菌后备用。1.2成骨细胞的培养本实验应用的成骨细胞来自大鼠颅盖骨其培养方法见文献〔4〕。1.3细胞在材料表面附着、增殖将La-HA涂层圆片放入24孔板内加入1ml的DMEM培养液浸泡24h后将细胞接种于材料表面浓度为5×107/L。无涂层圆片的培养板作为对照组（Con）；37℃φ(CO2)=5%的条件下用矿化液（含10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50mg/L维生素C的DMEM培养液）培养21d细胞分别在接种后第1、7、14和21天用0.25g/L胰酶0.3ml消化15min再加0.7ml的DMEM终止消化充分吹打后收集消化液。定量后在倒置显微镜下进行细胞计数每组重复3次取平均值。1.4细胞在材料表面的碱性磷酸酶活性将上述实验中各时间段的细胞悬液离心、弃上清加入体积分数为0.3%Triton-X100100μl4℃过夜将其移入96孔板内再加入100μl碱性磷酸酶底物液37℃孵育40min加入50μl的1mol/LNaOH终止反应在酶联免疫仪上用410nm波长测吸光度（A）统计分析。1.5细胞在材料表面的形态学观察将培养至第1、7、14、21天的涂层圆片分别取出用0.01mol/L的PBS（pH7.4）洗3遍体积分数为0.3%戊二醛固定乙腈梯度脱水临界点干燥喷金扫描电镜观察。2结果2.1细胞在材料表面的附着与增殖图1显示出第1、7、14、21天成骨细胞在材料表面附着及增殖的数量统计。可以看出成骨细胞在材料表面附着及增殖情况良好。第21天细胞增殖的数量几乎是第1天细胞附着数量的6倍。各时间段材料表面的细胞数量与对照组之间无显著差异（P≥0.05）。2.2细胞在材料表面的碱性磷酸酶活性通过测量成骨细胞分泌的碱性磷酸酶活性的相对强弱来表示成骨细胞在材料表面的功能。从第7、14、21天测试的碱性磷酸酶的吸光度（A）（图2）可以看出随着培养时间的增加碱性磷酸酶的活性逐渐增强各时间点与对照组之间无显著差异（P≥0.05）。图1成骨细胞在材料表面附着及增殖数图2成骨细胞在材料表面的碱性磷酸酶活性2.3成骨细胞在材料表面形态学观察图3显示扫描电镜下第1、7、14、21天成骨细胞在材料表面的形态。细胞接种在材料表面的第1天（图3a）伸展良好多个细胞突起牢固附着在材料表面。培养至第7天（图3b）细胞突起伸展到材料表面的颗粒间胞浆伸展并包裹材料表面的颗粒在细胞表面也有磷酸钙颗粒形成。第14天（图3c）细胞分泌基质并连接成网状牢固附着在材料表面及颗粒间。第21天（图3d）细胞分泌的细胞外基质更加丰富贯穿于材料的颗粒间材料表面也有再结晶形成。图3扫描电镜下成骨细胞在材料表面的形态学观察3讨论含镧的羟基磷灰石是本实验室新研究合成的钙磷陶瓷材料。在对其理化性能及细胞毒性进行研究的基础上将其作为涂层材料进行应用基础研究对发展和完善种植材料具有重要意义。本实验研究将成骨细胞接种在材料表面使植入材料与骨组织的主要功能细胞--成骨细胞相接触不仅可以