结缕草根际联合固氮菌培养条件研究.docx

结缕草根际联合固氮菌培养条件研究摘要:以结缕草根际土壤中筛选得到的5株联合固氮菌为试验材料对其培养条件以及典型生长曲线开展研究。结果表明菌株在10～45℃均可生长最适生长温度在20～30℃；最适生长初始pH值在7.0～7.5；菌株N4、N5、N6、N8的最佳通气量为220mL菌株N1最佳通气量为200mL；并在上述基础上经过进一步试验得到了菌株的典型生长曲线。试验数据对于了解掌握菌株的生长规律以及作为生物菌肥加以利用具有重要的意义。关键词：结缕草；联合固氮菌；培养条件；典型生长曲线中图分类号：Q93-335文献标识码：A文章编号：1009-5500(2011)05-0065-04联合固氮是自由生活的固氮菌定殖于植物根际土壤中形成的特殊固氮作用它们对植物生长有着一定的促进作用[1]。目前水稻、玉米等禾本科作物根际固氮菌的研究较深入[2-13]对于禾本科牧草固氮菌的研究较少。而近年来草坪业在我国作为新兴产业其发展速度日新月异但化肥的大量使用严重影响了土壤结构破坏了土壤的生态平衡而固氮菌可以为作物提供氮素营养并对促进生态系统中营养物质再循环维持生物圈的正常功能起着重要作用。因此固氮菌肥料在这一领域将会有广大的前景。试验对结缕草(Zoysiajaponica)根际土壤中分离到的5株固氮菌菌株的最适温度、最适pH值以及最佳通气量等条件进行研究在上述基础上测定各个菌株的典型生长曲线这些数据对有效地利用和促进菌株生长具有重要现实意义可为生物菌肥的研制及禾本科植物菌肥的使用提供必要的理论数据。1材料和方法1.1供试材料供试菌株为从海南大学校内结缕草草坪根际土壤中分离、纯化并经形态学、生理生化特性鉴定及固氮酶活性测定筛选得到的高效固氮菌株菌株标记为N1、N4、N5、N6、N8共5株供试菌株的鉴定已在《草原与草坪》2011年第1期上发表见参考文献［14］其固氮酶活性为194.5C2H4nmol/(mL•h)（N8）～215.4C2H4nmol/(mL•h)（N1）。培养基为LB液体培养基[15]。1.2试验设计试验均以未接菌的LB液体培养基为空白对照。1.2.1温度条件对菌株生长的影响按2%接种量分别将菌株接种到LB液体试管培养基中每个菌种接种4管分别于10、15、20、25、30、35、40、45℃振荡培养(180r/min)48h然后测定每个菌株的OD600nm吸光值并计算平均值以确定各菌株的最适生长温度。以OD600nm吸光值为纵坐标温度为横坐标生成坐标图。1.2.2初始pH对菌株生长的影响将菌株按2%接种量分别接种到pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的LB液体试管培养基中每个菌种接种4管置于180r/min28℃的振荡培养箱中培养48h然后测定其OD600nm的平均吸光值确定每种菌株的最适生长pH值。以OD600nm吸光值为纵坐标pH为横坐标生成坐标图。1.2.3通气条件对菌株生长的影响将菌株按5%的接种量接种到装液量为30、50、100、150和180mL的三角瓶（250mL）中28℃振荡培养(180r/min)48h后测定OD600nm的平均吸光值。确定每种菌株的最佳需氧量。以OD600nm吸光值为纵坐标通气量梯度为横坐标生成坐标图。1.3典型生长曲线的测定将各菌株分别从保存的试管斜面上取一环接种于10mL液体LB培养基中于28℃150r/min振荡培养12h作为种子液。按2%的接种量将种子液接种于200mLLB液体培养基中振荡混匀以每支10mL分装于标记为0、2、4、6、8、10、12…24h的13支试管中于每个菌株的最适培养条件下培养。按标记时间从上述试管中各吸取lmL培养液加入9mL灭菌生理盐水混匀后取出1mL加入下一支9mL无菌的生理盐水中依次类推对菌液作10倍梯度稀释稀释度为10-1、10-2、10-3直到10-10分别吸取各稀释度菌液0.1mL涂布LB平板3次重复于每个菌株的最适温度培养48h。计数菌液不同稀释度的3次重复的菌落数菌落数在30～300的为有效平板求其平均值。计算出供试菌株各生长时间的菌数。菌数(个/mL)=3个平板上菌落数的平均值×稀释倍数×102结果与分析2.1温度对菌株生长的影响5株固氮菌株在10～45℃的温度均能生长(图1)最适宜的生长温度为20～30℃菌株的最