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甲醛固定的不同组织中DNA提取的比较[摘要]目的研究运用改良酚-氯仿法从甲醛固定组织中提取DNA的方法对比心、肝、肺、脑4种脏器DNA提取质量的优劣从而了解哪种经甲醛固定后的组织易于得到质量较为可靠的DNA以达到对DNA扩增及后续研究的目的。方法选取甲醛固定标本脏器各14例以蛋白酶K消化和酚-氯仿法提取检材中DNA对所得DNA质量以紫外分光光度计、PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳分析进行结果判断。结果心、肝、肺、脑4种组织所提DNA的OD260/OD280比值分别为（1.842±0.380）、（1.861±0.076）、（1.387±0.113）、（1.428±0.087）。每100毫克组织中DNA含量（μg）分别为（0.944±0.530）、（1.096±0.544）、（0.348±0.273）、（0.601±0.238）。PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳分析显示心肌和肝脏组织的条带清晰度高于肺脏和脑组织。结论经甲醛浸泡固定的心肌组织和肝脏组织运用改良酚-氯仿法所得DNA质量较为可靠可以用于后续研究。[关键词]法医病理学；甲醛固定；改良酚-氯仿法；DNA提取[中图分类号]R91[文献标识码]A[文章编号]1674-4721（2013）07（b）-0116-03检材中DNA的提取是法医学中常用的一项技术同时也是分子生物学中研究基因功能的重要步骤[1]。目前从新鲜组织中提取高质量DNA的技术已经比较成熟但由于某些疾病的新鲜标本获取较为困难使通过新鲜组织进行DNA水平的研究相对受限。在国内几乎所有的医院及司法鉴定机构等都存在大量的经甲醛直接浸泡固定的组织其获取和保存较容易[2-3]然而这些组织中的DNA因甲醛的影响降解相对严重从中提取高质量的DNA非常困难能否成功提取这些组织的DNA往往在医疗纠纷及刑事案件中起着举足轻重的作用。在前期研究中本研究发现通过改良酚-氯仿法较其他方法更容易从甲醛固定组织中提取出DNA使得从组织中提取DNA开辟了一条新的途径[4]不过此提取方法在不同脏器组织所得DNA的质量及效率上是否存在差异其相关研究报道较少。本实验采用改良蛋白酶K消化和酚-氯仿法提取经甲醛固定的心、肝、肺、脑四种常见脏器的DNA并对其结果进行分析以期发现使用经甲醛浸泡固定的何种脏器更易于得到质量较为可靠的DNA以用于后续研究。1材料与方法1.1材料搜集2009～2012年山西医科大学司法鉴定中心经10%甲醛固定的标本14例每例分别取心、肝、肺、脑4种组织共56例样本均按同一种方法进行DNA提取。1.2方法从甲醛固定的每例样本中切取100mg用蒸馏水冲洗后在干燥研钵内碾磨碎再用2×蔗糖-Triton洗涤1000r/min离心15min弃去上清液沉淀用3mlTE缓冲液（pH9.0）打匀加SDS1ml加蛋白酶K在48℃水浴摇床中保温48h。取上清液依次用等体积苯酚、氯仿苯酚/氯仿（1∶1）在4℃条件下14000r/min离心10min重复2遍。取上清液加入预冷2倍体积的无水乙醇以及1/10体积的3mol/LNaAc颠倒混匀置于-20℃环境下30min。4℃条件下14000r/min离心10min。弃去上清液得到DNA沉淀用70%乙醇洗涤2遍14000r/min离心5min自然干燥沉淀。加TE（pH8.0）在4℃条件下过夜。-20℃保存备用。1.3DNA的测定1.3.1测定DNA的浓度将上述方法提取的DNA样品经紫外分光光度计于260nm和280nm处分别读取其吸光度（A）值DNA的纯度可根据OD260/OD280比值计算。1.3.2PCR的扩增PCR反应体系为20μl其中PremixTaq10μlDNA模板与去离子水混合体系8μl引物（GAPDH上游：5'-CAACAGCGACACCCACTCCT-3'下游：5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'）2μl。PCR反应条件：98℃条件下变性10s60℃条件下退火30s72℃条件下延伸60s循环次数为30次。1.3.3琼脂糖凝胶电泳（agarosegelelectrophoresisAGE）试验取扩增产物9μl加入PBE缓冲液1μl及Maker6μl同时上样经3.0%的AGE（100V40min）在紫外凝胶成像系统下观察所得DNA的PCR扩增结果。2结果2.14种组织所提取DNA的OD260/OD280值及其质量的比较在DNA的提取过程中由于甲醛的影响因素心肌、肺脏、脑组织所得DNA