一种表达猪圆环病毒3型ORF2基因的重组腺病毒及制备方法与应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110257428A(43)申请公布日2019.09.20(21)申请号201910584281.2A61P31/20(2006.01)(22)申请日2019.07.01(71)申请人武汉科前生物股份有限公司地址430000湖北省武汉市东湖新技术开发区高新二路419号(光谷生物城)(72)发明人张华伟徐高原朱娴静周明光陈波郝根喜方玉林(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人商秀玲(51)Int.Cl.C12N15/861(2006.01)C12N15/34(2006.01)C12N7/01(2006.01)A61K39/12(2006.01)权利要求书1页说明书8页序列表3页附图3页(54)发明名称一种表达猪圆环病毒3型ORF2基因的重组腺病毒及制备方法与应用(57)摘要本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种表达猪圆环病毒3型ORF2基因的重组腺病毒及制备方法与应用。本发明提供含有PCV3的Cap蛋白编码基因的重组腺病毒转移质粒和重组腺病毒。本发明通过人工密码子优化和信号肽选择，实现了PCV3的Cap蛋白的高水平分泌表达，得到的PCV3的Cap蛋白的结构和功能与天然状态完全一致，最大程度地保留了Cap蛋白的免疫原性，可以更好更快地被DC等抗原呈递细胞识别。本发明提供的腺病毒载体疫苗具有高度的免疫原性和安全性，能够有效激活机体的免疫反应，刺激动物产生高水平的特异性抗体和中和抗体，对猪圆环病毒发挥优异的免疫保护效果。CN110257428ACN110257428A权利要求书1/1页1.一种重组腺病毒转移载体，其特征在于，其含有目的基因片段，所述目的基因片段包含一个或多个拷贝的PCV3的Cap蛋白编码基因，所述PCV3的Cap蛋白编码基因的序列为经密码子优化得到的如SEQIDNO.1所示的序列。2.根据权利要求1所述的重组腺病毒转移载体，其特征在于，所述PCV3的Cap蛋白编码基因的5’端和3’端分别连接有IL-2信号肽序列和His标签肽序列；优选地，所述目的基因片段的序列如SEQIDNO.4所示。3.根据权利要求1或2所述的重组腺病毒转移载体，其特征在于，所述重组腺病毒转移载体为在CMV启动子后插入序列如SEQIDNO.4所示的目的基因片段的pShuttle-CMV载体或其衍生载体。4.一种重组腺病毒，其特征在于，其含有目的基因片段，所述目的基因片段包含一个或多个拷贝的PCV3的Cap蛋白编码基因，所述PCV3的Cap蛋白编码基因的序列为经密码子优化得到的如SEQIDNO.1所示的序列。5.根据权利要求4所述的重组腺病毒，其特征在于，所述PCV3的Cap蛋白编码基因的5’端和3’端分别连接有IL-2信号肽序列和His标签肽序列；优选地，所述目的基因片段的序列如SEQIDNO.4所示。6.权利要求4或5所述的重组腺病毒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将序列如SEQIDNO.4所示的目的基因片段插入pShuttle-CMV载体，构建重组腺病毒转移载体；(2)将所述重组腺病毒转移载体线性化后转入含有骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌中，进行同源重组，得到重组腺病毒质粒；(3)将所述重组腺病毒质粒线性化后转染至哺乳动物细胞，进行重组腺病毒的包装和扩增，得到所述重组腺病毒。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述将序列如SEQIDNO.4所示的目的基因片段插入pShuttle-CMV载体采用同源重组的方法；优选地，采用序列分别如SEQIDNO.7-8所示的引物扩增所述目的基因片段后与线性化的载体通过同源重组连接。8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌为BJ5183菌株，和/或，所述哺乳动物细胞为HEK-293T细胞。9.权利要求1～3任一项所述的重组腺病毒转移载体或权利要求4或5所述的重组腺病毒在制备PCV3疫苗中的应用。10.一种PCV3的腺病毒载体疫苗，其特征在于，包含权利要求4或5所述的重组腺病毒。2CN110257428A说明书1/8页一种表达猪圆环病毒3型ORF2基因的重组腺病毒及制备方法与应用技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种表达猪圆环病毒3型ORF2基因的重组腺病毒及制备方法，以及利用该重组腺病毒制备的猪圆环病毒3型腺病毒载体疫苗。背景技术[0002]猪圆环病毒(PorcineCircovirus，PCV)为单股环状DNA病毒，是最小的动物DNA病毒之一，会引起仔猪多系统衰竭综合征、猪呼吸系统混合疾病、猪繁殖障碍症、猪皮炎肾病综合征等，对养猪业造成严重的危害。猪圆环病毒早期确定有两种类型，包括圆环病毒1型(PCV1)和圆环病毒2型(PCV2)。在2015年美国一猪场的