寒湿痹阻型痹证患者的安全.docx

寒湿痹阻型痹证患者的安全《北京中医药杂志》2014年第五期1材料1.1中药药材:附子复方中药药材全部由北京中医药大学东方医院药学部中草药房提供其中附子为制附片。附子复方基本药物组成:制附片(15g/30g/50g)白芍(15g/20g/30g)干姜(15g/20g/30g)甘草(15g/20g/30g)等。1.2试剂:氨水(分析纯):500mL/瓶(西陇化工股份有限公司批号1206183)甲醇(分析纯):500mL/瓶(北京化工厂:批号20120330)去离子水(怡宝纯净水)1.55L/瓶(广州怡宝纯净水有限公司)内标液(氢溴酸高乌甲素浓度200ng/mL):由广州中医药大学中医药数理工程研究院提供成品。1.3实验仪器:旋涡混合仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司型号:XW-80A)台式离心机(珠海黑马医学仪器有限公司型号:16K)氮吹仪(天津市恒奥科技发展有限公司型号:HSC-24B)。2方法2.1分组与编号入组受试者共56例均为北京中医药大学东方医院风湿科门诊及病房患者编号1～56分别予《寒湿痹阻型痹证中医症状评分表》测得症状积分根据症状积分进行证候分级分级标准为轻度:≤10分;中度:11～19分;重度:≥20分［4］。2.2水煎剂制备与给药方法根据各受试者轻、中、重度证候分级分别给予含制附片15、30、50g的中药复方所有水煎剂均由北京中医药大学东方医院制剂室统一代煎每剂2袋每袋150mL。受试者于晨起空腹服用第1袋水煎剂后开始计时按照各自所选取的采血点进行采血采血完毕后方可进服第2袋水煎剂。2.3采血方法56例受试者每人随机抽取2个采血点共计112个血样具体方法:受试者编号为1～56依次每7例为一组共8组各组每例受试者从14个采血点(5、10、15、30、45、60、75、90、120、180、240、360、720、1440min)中随机选取2个数字代表其2个采血时间点(同一组内如遇到2个相同随机数字则舍去后1个)。各受试者服药后于相应采血点取血2mL加入抗凝管3000r/min离心5min后取上清液血浆备用平行2份样品。2.4样品处理取200μL含药受试者血浆和20μL内标液(氢溴酸高乌甲素200ng/mL)上样采用WatersHLB(30mgsorbent)柱固相萃取方法进行处理:(1)活化:萃取柱使用前先用甲醇和去离子水进行预处理;(2)涡旋和上样:将含药血浆内加入内标液使用涡旋混合器均匀混合混合液加入已活化萃取柱;(3)洗脱:先后用5%甲醇-水和5%氨水-甲醇洗脱收集洗脱液作为样品;(4)吹干:将洗脱液置于40℃水浴机内并以高纯氮气吹干;(5)密封和储存:封口胶密封试管－20℃环境保存样品待测。2.5样品检测每周将制备的临床血浆样品邮寄至课题合作单位广州中医药大学中医药数理工程研究院应用快速、灵敏特点的液质联用仪检测附子生物碱血药浓度检测条件:(1)实验仪器:WatersUPLCQuattroPremier液质联用仪(美国沃特世科技有限公司)TDL-5-A离心机(上海安亭科学仪器厂)XK-96微量振荡器(江堰市新康医疗器械有限公司);(2)色谱条件:色谱柱(WATERSACQUITYUPLCBEHC18)流动相(CH3OH-0.2%HCOOH梯度洗脱);(3)质谱条件:离子源(电喷雾离子化源)正离子检测(电子喷雾电压)采用多反应检测(MRM)。3结果将样品200μL用流动相涡旋30s溶解取5μL注入UPLC-MS/MS系统进行分析采用内标法计算生物碱的血药浓度。3.16种生物碱随行对照品色谱图随行对照品色谱图见图1。3.2群体药动学病例的附子血药浓度含量依据附子6种生物碱最低定量限0.1ng/mL检测结果发现受试者血浆中仅检测到HA、BAC、BMA和BHA4种生物碱另外2种生物碱AC、MA因浓度未达到检出限而无法计算血药浓度。4种生物碱血药平均浓度及SD值见表1。根据4种生物碱的血药平均浓度绘制血药浓度-时间曲线见图2。由图2所示4种生物碱的血药平均浓度达峰时间点均为75min;BMA在各时间点的血药平均浓度均明显高于其他3种生物碱并且达峰平均浓度最高其后依次为BHA、HA、BAC。图24种生物碱血药浓度－时间曲线3.3药动学参数经DAS2.1.1软件拟合结果显示各生物碱最佳房室模型为二室模型相关各药代动力学参数见表2。4讨论关于附子的毒性和用量古籍记载历代医家用量不一2005年版《中华人民共和国药典》规定附子的用量为3～15g因治疗需要可用至15～30g。然而随着“火神派”的崛起和发展其对附子的用量多超常规剂量少则50g多