一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112485341A(43)申请公布日2021.03.12(21)申请号202011143516.3(22)申请日2020.10.23(71)申请人上海速贸特生物科技有限公司地址201411上海市奉贤区神州路639号2幢3层306室(72)发明人傅海军(74)专利代理机构北京盛凡智荣知识产权代理有限公司11616代理人王勇(51)Int.Cl.G01N30/02(2006.01)G01N30/14(2006.01)权利要求书1页说明书11页(54)发明名称一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法(57)摘要本发明公开了一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法，包括以下步骤：步骤一：样品前处理；步骤二：根据激素类化合物化学和物理特性，采用超高效液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测；步骤三：定性判断和定量分析：根据目标激素与其内标物的相对保留时间、定量离子对的丰度比、目标激素的定性离子与定量离子的丰度比，来判断激素是否存在于血浆样品中，采用同位素内标定量法，以激素与其内标物的峰面积比值计算样品中的激素的含量。本发明与现有技术相比的优点在于：有效去除大部分的干扰物质，可以同时检测和快速提取多种激素。CN112485341ACN112485341A权利要求书1/1页1.一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一：样品前处理：向待测标本加入内标，混匀后加入甲醇，振荡混匀，再加入去离子水，再次振荡混匀后离心，取上清液置于96孔板萃取装置中，依次用淋洗液乙腈/水、正己烷淋洗，再用洗脱液乙腈/甲醇、水依次洗脱；其中，所述的淋洗液乙腈/水的体积比(V:V)为5:95～20:80，所述的洗脱液乙腈/甲醇体积(V:V)比为95:5～80:20；步骤二：根据激素类化合物化学和物理特性，采用超高效液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测，所述液相色谱条件包括：C8色谱柱,100mmx2.1mm,1.7μm，色谱柱柱温：45℃，流动相组成：A，0.1mMNH4F；B，甲醇，流速：0.4mL/min，并制定梯度洗脱条件；所述的质谱检测条件：采用负离子模式，扫描方式采用多反应监测离子扫描，并检测目标定量母子离子对和内标定量母子离子对；质谱离子源参数包括：气体：脱溶剂气为氮气，碰撞气为氩气，毛细管电压：3.5kV，采样锥孔电压：20～80V，碰撞能量(CollisionEnergy,CE)：15～60V，脱溶剂气流速：800～1000L/h，锥孔反吹气：100L/h，脱溶剂气温度：500℃；步骤三：定性判断和定量分析：根据目标激素与其内标物的相对保留时间、定量离子对的丰度比、目标激素的定性离子与定量离子的丰度比，来判断激素是否存在于血浆样品中；应用超高效液相色谱串联四级杆质谱法对样品进行定性分析：在相同实验条件下，样品中待测目标物的色谱保留时间与标准品溶液中相应物质的色谱保留时间一致；样品总离子流色谱图中所选择的检测离子对的相对丰度与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比的偏差不超过规定范围，则可以判断样品中存在相应的目标化合物；采用同位素内标定量法，以激素与其内标物的峰面积比值计算样品中的激素的含量。2.根据权利要求1所述的一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法，其特征在于：步骤一中对加入甲醇和去离子水后的离心的条件可以包括：室温下，8000～12000g离心5～10分钟。2CN112485341A说明书1/11页一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法技术领域[0001]本发明涉及检测血浆中激素的方法技术领域，具体是指一种利用液相色谱串联质谱技术检测血浆中激素的方法。背景技术[0002]目前测定激素的方法主要有生物法和化学法。生物法包括酶联免疫吸附(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫化学发光分析(ICMA)等，化学法包括气相色谱‑质谱法(GC‑MS、GC‑MS/MS)[和液相色谱‑质谱法(LC‑MS/MS)。[0003]生物法在过去被认为是测定生物样品中激素的理想方法，但是现在的研究发现生物法存在一定的缺陷。首先，激素类代谢物在结构上具有高度的相似性，因此，使用免疫测定法很难控制或排除生物基质中可能存在的结构相似物的干扰。其次，免疫检测方法是建立在抗体对抗原分子识别的基础上，而人体内激素结构相似，免疫检测技术的特异性抗体的交叉反应的专一性差，易出现假阳性结果。第三，并不是所有的目标激素代谢物都存在相应的抗血清以得到准确的免疫测定，这一点对于激素结合物的免疫测定尤为明显。最后，免疫检测一次只能分析一种被测物，因此测定一种激素的多种代谢物就需要多次测定。[0004]近年来，质谱技术已发展成为分析内源性代谢物和药物的高通量